【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备抗体-药物缀合物(adc)的方法。具体地，本专利技术涉及用于制备具有改善的同质性的抗体-药物缀合物(adc)的生物缀合方法。
技术介绍
1、抗体对于靶细胞和分子表面上的特定抗原的特异性已使它们被广泛用作各种各样的诊断剂和治疗剂的载体。例如，与标记物和报道基团如荧光团、放射性同位素和酶缀合的抗体用在标记和成像应用中，同时与细胞毒性剂和化疗剂的缀合允许将这些药剂靶向递送至特定组织或结构，例如特定细胞类型或生长因子，将对于正常健康组织的影响最小化，并且显著降低与化疗相关的副作用。抗体-药物缀合物(adc)是抗体和药物的缀合物，并且在数个疾病领域中、特别是在癌症中具有广泛的潜在治疗应用，并且成为用于疾病治疗的新的靶向药物。adc含有用于靶向的抗体、用于药物连接的连接物或接头和作为效应物的高效力有效负载(例如，药物)。自从us fda在2011年批准adcetris和在2013年批准kadcyla，adc药物开发已经广泛扩展用于治疗癌症。
2、特别地，抗体-药物缀合物(adc)是一类重要的高度有效的生物制药学药物，其设计作为靶向疗法用于治疗癌症受试者。adc是复杂分子，由与生物学活性的细胞毒性(例如，抗癌)药物连接的抗体组成。adc将抗体和细胞毒性药物两者的理想性质组合：将有效的细胞毒性药物靶向表达抗原的细胞，由此增强其靶向细胞毒性活性。与传统的化学治疗剂药物相比，抗体-药物缀合物仅靶向癌细胞，由此健康细胞受到影响的严重性较低(dijoseph,jf；armellino,dc；boghaert,er；kh
3、在开发抗体-药物缀合物过程中，将抗癌药物与抗体偶联，所述抗体特异性地靶向某个肿瘤标记物(例如，理想地仅在肿瘤细胞之中或之上发现的蛋白)。抗体追踪体内的这些蛋白并且将它们自身附着于癌细胞表面。抗体和靶蛋白(即，抗原)之间的生物化学反应触发了肿瘤细胞中的信号，其然后将抗体以及细胞毒素一起吸收或内化。在adc被内化后，细胞毒性药物被释放并且杀死肿瘤细胞(chari,ravi v.j.；martell,bridget a.；gross,jonathan l.；cook,sherrilyn b.；shah,sudhir a.；walter a.；mckenzie,saraj.；goldmacher,victor s.(1992)，“immunoconjugates containing novelmaytansinoids:promising anticancer drugs(含有新的美登素类化合物的免疫缀合物：有希望的抗癌药物)”.cancer research.52(1):127-31.)。由于这种靶向，所以理想地adc具有比其他化学治疗剂更低的副作用并且提供更宽的治疗窗。
4、对于药物连接，利用对于抗体和接头-有效负载(即，接头-药物)两者都具有高度反应性和稳定性的官能团进行偶联，以形成稳定的共价键。常规的连接方式，即将药物部分与抗体经由接头共价结合，通常导致异质分子混合物，其中药物部分连接在抗体的数个位点上。例如，细胞毒性药物已经典型地通过抗体中通常含有的多个赖氨酸残基缀合于抗体，产生异质的抗体-药物缀合物混合物。
5、例如，抗体-药物缀合物通常通过两种常规化学策略产生：基于赖氨酸的缀合和基于半胱氨酸的缀合，所述半胱氨酸来自链间硫键还原。对于赖氨酸残基上的伯胺基团的反应而言，最广泛使用的接头-有效负载上的连接物是nhs酯(即，n-羟基琥珀酰亚胺)。但是nhs酯在抗体-药物缀合物生产中的应用受限于其固有性质，例如nhs酯和伯胺之间的反应在酸性条件下非常慢，因此缀合需要在高ph值(即>7.0)的缓冲液中进行，然而高ph值对于抗体有时并不友好，并且nhs倾向于在碱性条件下水解，这使得缀合后游离药物的纯化和鉴定变得更复杂。此外，由于nhs酯与抗体上的伯胺的低反应性，反应需要在高温(即22℃)下进行。此外，由于低溶解度，通过nhs酯(即smcc-dm1)制备的接头-有效负载需要更多的有机溶剂来完全溶解于反应体系中，这增加了抗体聚集的风险。对于基于来自链间硫键还原的半胱氨酸的缀合，它包括在各种还原剂(如tcep、dtt等等)的存在下打开链间二硫键的步骤，接着发生巯基的亲核反应。在该缀合过程中，抗体-药物缀合物典型地如下形成：将一个或多个抗体半胱氨酸巯基与一个或多个与药物结合的接头部分缀合，由此形成抗体-接头-药物复合物。与大多数胺(其在ph 7附近质子化和较不亲核)不同，半胱氨酸巯基在中性ph下具有反应性。由于游离巯基(rsh，硫氢基)基团相对具有反应性，所以具有半胱氨酸的蛋白经常以它们的氧化形式作为二硫键连接的寡聚物存在或者具有内部桥连的二硫键。与抗体胺或羟基相比，抗体半胱氨酸巯基对于亲电缀合试剂通常是更具反应性的，即更亲核的。通过将蛋白的多个氨基酸残基突变为半胱氨酸而对半胱氨酸巯基进行改造是可能有问题的，特别是在未配对的(游离cys)残基或对于反应或氧化而言相对可及的那些的情况下。在浓缩的蛋白溶液中，无论在大肠杆菌的周质、培养物上清液，还是部分或完全纯化的蛋白中，蛋白表面上的未配对的cys残基可以配对和氧化以形成分子间二硫键，并且因此可以形成蛋白二聚体或多聚体形式。二硫键二聚体形成使得新cys对于与药物、配体或其他标记的缀合不起反应。此外，如果蛋白在新改造的cys和已有的cys残基之间氧化形成分子内二硫键，则两个cys基团都不能用于活性位点参与和相互作用。另外，通过错误折叠或者丧失三级结构，可以使得蛋白无活性或者非特异性的(zhang等(2002)anal.biochem.311:1-9)。
6、开发新的作为治疗剂的adc是非常重要的。然而，常规的缀合方法总是导致异质分子混合物，其中药物部分连接于抗体上的数个位点。取决于反应条件，异质混合物典型地含有具有从0至约8或更多的连接的药物部分的抗体分布。另外，在具有特定整数比率的药物部分/单个抗体的每个缀合物亚类中，存在其中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备抗体-药物缀合物(ADC)混合物的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述缓冲体系是Hepes、组氨酸缓冲液、PBS或MES，并且所述缓冲体系的pH值为5.5至8。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述抗体的浓度为0.01-0.1mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)在-10℃至37℃的温度下进行，优选地，步骤(a)在0℃至20℃的温度下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的还原剂为TCEP。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有反应性基团的有效负载是携带药物的马来酰亚胺、携带药物的溴化物或携带药物的碘化物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体，优选地，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或它们的抗原结合部分。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是IgG1同种型或IgG4同种型。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效负载包含诊断剂、治疗剂
10.根据权利要求1所述的方法，其中基于D0、D2、D4、D6和D8的总重量，所述抗体-药物缀合物(ADC)混合物中D4的重量百分比高于65％，优选地高于70％。
11.根据权利要求1所述的方法，其中基于D0、D2、D4、D6和D8的总重量，所述抗体-药物缀合物(ADC)混合物中D0与D8一起的重量百分比低于10％，并且D6的重量百分比低于10％。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(b)中，四个具有反应性基团的有效负载连接于一个抗体的Fab区中的还原巯基。
13.通过权利要求1-12中任一项的方法制备的抗体-药物缀合物(ADC)混合物，其中基于D0、D2、D4、D6和D8的总重量，所述抗体-药物缀合物(ADC)混合物中D4的重量百分比高于65％，优选地高于70％。
14.根据权利要求13所述的抗体-药物缀合物(ADC)混合物，其中基于D0、D2、D4、D6和D8的总重量，所述抗体-药物缀合物(ADC)混合物中D0与D8一起的重量百分比低于10％，并且D6的重量百分比低于10％。
15.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求13-14中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)混合物和药用载体或媒介物。
16.根据权利要求13-14中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)混合物在制备用于治疗受试者中的病症或疾病的药物组合物或试剂盒中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述病症或疾病是肿瘤、癌症、自身免疫病或传染病，优选地，其中所述传染病是病毒性或微生物感染。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选地，其中所述受试者是人。
...【技术特征摘要】
1.一种制备抗体-药物缀合物(adc)混合物的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述缓冲体系是hepes、组氨酸缓冲液、pbs或mes，并且所述缓冲体系的ph值为5.5至8。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述抗体的浓度为0.01-0.1mm。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)在-10℃至37℃的温度下进行，优选地，步骤(a)在0℃至20℃的温度下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的还原剂为tcep。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有反应性基团的有效负载是携带药物的马来酰亚胺、携带药物的溴化物或携带药物的碘化物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体，优选地，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或它们的抗原结合部分。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是igg1同种型或igg4同种型。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效负载包含诊断剂、治疗剂或标记试剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中基于d0、d2、d4、d6和d8的总重量，所述抗体-药物缀合物(adc)混合物中d4的重量百分比高于65％，优选地高于70％。
11.根据权利要求1所述的方法，其中基于d0、d2、d4、d...
【专利技术属性】
技术研发人员：吉傲，孙楚楚，贺文旭，
申请(专利权)人：上海药明合联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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