一种中国家蝇抗菌肽１及其分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种中国家蝇抗菌肽１及其分离纯化方法。所述中国家蝇抗菌肽１，包括５个肽段。其分离纯化方法，包括以下步骤：１）对家蝇进行免疫诱导；２）将免疫诱导后的家蝇进行组织匀浆，取含有抗菌肽的样品溶液；３）将样品溶液进行透析浓缩，得到浓缩样品；４）将浓缩样品进行超速离心过滤，得到半纯品抗菌肽；５）将半纯品抗菌肽进行ＨＰＬＣ分离纯化，得到色谱纯中国家蝇抗菌肽１。本发明专利技术所述中国家蝇抗菌肽１是最新发现的一种小分子肽，抗菌肽的活性较强，是一类具有发展潜力的，对多重耐药菌有抵抗作用的新型抗菌药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物抗菌肽领域，尤其涉及。
技术介绍
抗生素的广泛应用，耐药菌株和多重耐药菌株日益增加，临床抗感染治疗已面临 严峻挑战，寻找广谱高效的抗细菌、抗病毒药物，仍然是一个十分艰巨的任务。蝇主要生长 在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其体表带有许多病原菌，能传播多种疾 病。但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇应该对病原微生物有强大的免 疫力，并能产生强效抗菌物质。生物抗菌肽具有广谱抗菌活性，对G+、C'细菌及真菌都有抗菌活性，特别是对多重 耐药菌也有抗菌活性。另外还具有抗肿瘤细胞的作用，与传统抗生素相比，还有促进伤口愈 合和免疫调节等作用，是一类具有发展潜力的新型抗菌药。该领域目前国际上研究较为活跃，找到并能纯化出抗菌谱宽、抗菌活性强的抗菌 肽将会有广阔的开发应用前景。不同抗菌肽分子大小，生物学特征有一定差别，目前肽类的纯化技术较复杂，要分 离纯化单一肽类技术难度较大。在抗菌肽的研究中，抗菌肽分离纯化方法的建立是个技术 难点，要建立一个结果稳定可靠、操作简单的方法，需要大量工作，反复试验。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的主要目的在于提供一种中国家蝇抗菌肽1，该抗菌肽具 有广谱、高效的抗菌活性。本专利技术的第二目的在于提供一种从中国家蝇体内分离纯化中国家蝇抗菌肽1的 方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种中国家蝇抗菌肽1，包括5个肽段，所述5个肽段的氨基酸序列分别如SEQID NO :1 至 SEQ ID NO 5 所示。一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，包括以下步骤1)对家蝇进行免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽；2)将免疫诱导后的家蝇进行组织勻浆，取含有抗菌肽的样品溶液；3)将含有抗菌肽的样品溶液进行透析浓缩，得到浓缩的样品；4)将浓缩的样品进行3TGC00超滤柱进行超速离心过滤，得到半纯品抗菌肽；5)将半纯品抗菌肽进行HPLC分离纯化，得到色谱纯中国家蝇抗菌肽1。所述步骤1)具体为先使家蝇麻醉，然后带有细菌悬液的不锈钢针刺透体壁，再 使其复苏，刺伤后在温度28 30°C饲养24h，通过损伤感染免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽。所述细菌悬液为大肠埃希氏菌悬液、铜绿假单胞菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液。3所述步骤3)具体为首先将含有抗菌肽的样品溶液4°C下60000g离心60min，除 去沉淀和上层漂浮的脂肪层；再取上清液装入分子量截留值为1500U的透析袋内，包埋于 聚乙二醇中，在4°C下透析过液。所述步骤4)具体为透析浓缩的样品60000g离心30min，取上清用UFC3TGC00超 滤柱，以60000g离心超滤。所述步骤5)具体为样品超滤液采用RT-HPLC半制备柱纯化，半制备柱上样量为 1. Oml 2. 0ml，流速为1. Oml/min，在214nm检测波长下，当开始出峰时，进行样品的部分收 集。保留时间为18. OOSmin时的收集品为色谱纯中国家蝇抗菌肽1用上述方法制备的中国家蝇抗菌肽1。本专利技术所述中国家蝇抗菌肽1是最新发现的一种小分子肽，抗菌肽的活性较强， 能非特异性地抗细菌，是一类具有发展潜力的，对多重耐药菌有抵抗作用的新型抗菌药。本专利技术所述中国家蝇抗菌肽1分离纯化方法，具有简便易行，稳定性、重复性好等 优点，不同批次纯化的抗菌活性用Lowry法测定多肽含量，其蛋白质浓度范围为0. 20g 0. 25g/L，是一种有实用价值的全新的抗菌肽分离纯化技术。说明书附1是3TGC00超滤柱进行超速离心过滤，得到半纯品的中国家蝇抗菌活性组分的 RP-HPLC色谱图；图2是纯化中国家蝇抗菌肽1的RP-HPLC分析柱分析色谱图；图3是Si^phadex G50层析收集的中国家蝇抗菌肽1对铜绿假单胞菌的抗菌活性 试验结果图，15(80min 85min)、16(85min 90min)、17(90min 95min)为不同保留时间 收集的样本，加样量20yg蛋白质/纸片；图4是中国家蝇抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段1的质谱图；图5是中国家蝇抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段2的质谱图；图6是中国家蝇抗菌肽ITricine SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。具体实施例方式实施例1 一种中国家蝇抗菌肽1中国家蝇抗菌肽1经胰蛋白酶水解后得到5个酶解片段，酶解片段用 Nano-ESI-MS/MS技术进行质谱分析，测定出的质谱信息借助Micromass的专用软件MasSeq 进行序列分析，得到5个肽段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 1-5所示(1)YDNVNLDELLNSDR(T0F MSMS 840. 47ES+, Query 4)Tyr-Asp-Asn-Val-Asn-Leu-Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ser-Asp-Arg(2)YDLLNVDEEVRFR(T0F MSMS 826. 95ES+, Query 5)Tyr-Asp-Leu-Leu-Asn-Val-Asp-Glu-Leu-Val-Arg-Phe-Arg(3)QPNLYYNK(T0F MSMS 520. 30ES+, Query 2)Gln-Pro-Asn-Leu-Tyr-Tyr-Asn-Lys(4)PNNVYYTK(T0F MSMS 499. 76ES+, Query 1)Pro-Asn-Asn-Val-Tyr-Tyr-Thr-Lys(5)DYPNNVYYTK(T0F MSMS 639. 34ES+, Query 3)4Asp-Tyr-Pro-Asn-Asn-Val-Tyr-Tyr-Thr-Lys质谱图经Micromass的专用软件MaxEnt3处理后，借助Micromass的专用软件 MasSeq直接推导出肽段序列。用Spectrum List通过Mascot查询NCBInr数据库，经检索 未发现有与之序列相匹配的蛋白质，可以证明本专利技术分离纯化到的家蝇抗菌肽是一个新的 抗菌肽，命名为家蚬抗菌肽 1 (Musca domestica antibacterial peptide l,MdAPl)。肽段 1的质谱图见图4，肽段2的质谱图见图5。实施例2 —种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法包括以下步骤1.免疫诱导把家蝇分为试验组和对照组，对照组不进行损伤诱导处理。试验组把盛有乙醚的 培养皿放在蝇笼内，使蝇麻醉，然后用沾有细菌悬液的不锈钢针刺透体壁，立即放入另一笼 内使其复苏。刺伤后在温度28 30°C饲养24h。通过损伤感染免疫诱导，使家蝇产生抗菌 肽。细菌为大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌，2.组织勻浆家蝇1. Og加液氮7g的比例混合，迅速用研钵研磨，或幼虫放-80°C冷冻过夜， 取出放研钵内在冰浴下研磨成细沫状，加少量4°C buffer A(含尿素2. 0mol/L,0. 2mol/L pH6. 8Tris-HCl)继续研磨成糊状，以Ig组织加IOml bufferA的比例混勻，4°C下60000g离 心60min，取上清液_80°C保存备用。3.透析浓缩将_80°C贮存的样品溶液取出，室温下融化，4°C下60000g离心60min，除去沉淀和 上层漂浮的脂肪层，取上清液装入分子量截留值为1500U的透析袋内，包埋于聚乙二醇中， 在4 °C下透析过液。4.透析浓缩的样品60000g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中国家蝇抗菌肽１，其特征在于，包括５个肽段，所述５个肽段的氨基酸序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周义文，姬尚义，申萍，涂植光，尹一兵，
申请(专利权)人：周义文，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]