【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和分子生态学，具体涉及基于rpa技术现场检测巴西龟的引物探针组合、试剂盒及方法。
技术介绍
1、巴西龟(trachemys scripta elegans)也称红耳龟，属龟鳖目动物，头较小，背甲呈圆环状绿纹，腹甲为铜钱样环纹，原产地为美洲密西西比河及格兰德河流域。我国最初引进巴西龟是以食用为目的，因其食性广、适应性强、生长繁殖快、产量高，以及抗病能力强等特点，引进后在中国南方地区广泛养殖。随着我国经济的发展，目前巴西龟更多作为宠物交易。但是在长期发展过程中，由于巴西龟极强的繁殖能力、环境适应能力以及“宠物弃养”“养殖逃逸”等因素的影响，使巴西龟在我国生态环境中肆意增长。因此，有必要对其进行监测。
2、环境dna(environmental dna，简称edna)技术是一种基于生物体在环境中释放的dna片段进行检测和分析的新兴技术，生物体通过蜕皮、粪便、尿液、孢子、鳃腔粘液等方式，在环境中释放dna片段，这些dna片段称为环境dna。环境dna在生物多样性研究中的优势在于能从环境样品中获得目标生物dna，在不影响生物体的同时能取得较为全面的生物体信息。环境dna样本背景复杂，可能含有多物种dna，若要在其中检测目标物种dna，要求检测方法相对其他物种尤其是近缘物种具有好的特异性，对于检测方法的灵敏度要求也更高。
3、对于物种的检测，pcr是一种常见的方法，通过提取dna进行扩增，根据电泳或者扩增曲线判断是否存在目标物种。若是将edna技术与pcr扩增技术相结合，可以实现无害化检测巴西
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术的目的之一是提供基于rpa技术现场检测巴西龟的引物探针组合，能够利用重组酶聚合酶扩增(rpa)技术在较低温度下特异性扩增出巴西龟dna。
2、具体的，所述引物探针组合选自以下两组之一：
3、第一组(tra2)：包括序列如seq id no.1所示的上游引物、序列如seq id no.2所示的下游引物、序列如seq id no.3所示的探针。
4、第二组(tra3)：包括序列如seq id no.4所示的上游引物、序列如seq id no.5所示的下游引物、序列如seq id no.6所示的探针。
5、本专利技术的目的之二是提供包括上述基于rpa技术现场检测巴西龟的引物探针组合的试剂盒。
6、本专利技术的目的之三是提供包括上述基于rpa技术现场检测巴西龟的方法，包括以下步骤：
7、s1.水样抽提：利用滤膜进行待测水样过滤；
8、s2.edna提取：利用chelex-100法提取滤膜中的edna；
9、s3.rpa扩增：利用上述试剂盒对提取到的edna进行rpa扩增反应；
10、s4.lfd检测：反应结束后，将反应液滴加在带有抗fam和biotin标记的lfd试纸条进行检测，根据lfd试纸条检测线和质控线的条带显示情况判断有无巴西龟的存在。当检测线和质控线都显示条带，则结果为阳性(存在巴西龟)；若检测线未显示条带，质控线显示条带，则结果为阴性(不存在巴西龟)；若质控线未显示条带，则检测无效。
11、优选的，步骤s3中，rpa扩增的反应体系为：10μm的上下游引物各2μl、10μm的探针0.6l、buffer a 29.4μl、buffer b2.5μl、dna模板2μl、无酶无菌水11.5μl。所述buffer a和buffer b均来自安普未来生物科技有限公司dna恒速快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)。
12、优选的，步骤s3中，rpa扩增的反应条件为：将配制好的反应体系在38℃金属浴孵育3-5min后，取出反应体系涡旋离心25-35s，再放入38℃金属浴继续反应7-9min。
13、本专利技术具有以下有益效果：
14、本专利技术筛选出两组巴西龟的rpa特异性引物与探针，结合侧流层析试纸条检测法，建立了一种巴西龟的rpa-lfd检测方法。该方法操作简便、灵敏性高、特异性强、短时间内实现结果可视，能够满足环境dna样本的检测要求；且不需要精密仪器，在38℃、50min内即可得到检测结果，能够实现现场检测，适合野外快速监测。
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1.基于RPA技术现场检测巴西龟的引物探针组合，其特征在于：选自以下两组之一：
2.基于RPA技术现场检测巴西龟的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基于RPA技术现场检测巴西龟的引物探针组合。
3.基于RPA技术现场检测巴西龟的方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的基于RPA技术现场检测巴西龟的方法，其特征在于：步骤S3中，RPA扩增的反应体系为：10μM的上下游引物各2μL、10μM的探针0.6L、buffer A 29.4μL、buffer B 2.5μL、DNA模板2μL、无酶无菌水11.5μL。
5.根据权利要求3所述的基于RPA技术现场检测巴西龟的方法，其特征在于：步骤S3中，RPA扩增的反应条件为：将配制好的反应体系在38℃金属浴孵育3-5min后，取出反应体系涡旋离心25-35s，再放入38℃金属浴继续反应7-9min。
【技术特征摘要】
1.基于rpa技术现场检测巴西龟的引物探针组合，其特征在于：选自以下两组之一：
2.基于rpa技术现场检测巴西龟的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基于rpa技术现场检测巴西龟的引物探针组合。
3.基于rpa技术现场检测巴西龟的方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的基于rpa技术现场检测巴西龟的方法，其特征在于：步骤s3中，rpa扩增的反应体系为...
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