【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因的引物对组合物、方法和试剂盒。
技术介绍
1、碳青霉烯类药物是抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗多重耐药细菌引起的严重感染最主要的抗菌药物之一。其结构与青霉素类的青霉环相似，不同之处在于噻唑环上的硫原子为碳所替代，且c2与c3之间存在不饱和双键；另外，其6位羟乙基侧链为反式构象。其在国内已经上市的品种有亚胺培南，美罗培南，帕尼培南，厄他培南，比阿培南等。
2、碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(carbapenem resistant enterobacterales，cre)通常会导致住院患者难以治疗的感染，已被世界卫生组织视为关键病原体，以指导新抗生素的发现、研究和开发。
3、肠杆菌目细菌对碳青霉烯类耐药性与两种主要机制有关：第一种为获得碳青霉烯酶，如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(kpc)、新德里金属β-内酰胺酶(ndm)和苯唑西林酶(oxa)，进而水解碳青霉烯类抗生素，约占90％以上；第二种为超广谱的β-内酰胺酶(esbls)和/或头孢菌素酶(ampc)的过度表达联合孔蛋白改变(修饰孔蛋白、孔蛋白表达缺失或孔蛋白类型改变)降低外膜通透性，以及和/或外排泵高表达，占比低于10％。
4、cre感染与高死亡率相关，主要是由于有效治疗的延迟。大量研究表明，早期正确使用抗生素对cre感染的治愈起着至关重要的作用。因此，准确、快速诊断患者是否为cre感染对治疗非常重要，可以帮助临床医生尽快选择合适的抗生素，缩短治疗时间
5、传统微量肉汤稀释法检测碳青霉烯耐药表型需要足够的培养时间，至少16-18h。clsi自2015年和2017年以来分别推荐carba np试验和mcim/ecim来检测产碳青霉烯酶的耐碳青霉烯肠杆菌目细菌，即cp-cre。然而carba-np试验虽然缩短了检测时间，但对oxa型碳青霉烯酶的检测存在局限性，并且不能区分kpc酶、金属酶等型别。虽然使用mcim检测cp-cre没有碳青霉烯酶类型的限制，但也非常耗时。商业化胶体金法检测碳青霉烯酶可在20min内完成。但是与carba np试验和mcim/ecim面临相同问题：仅能对培养后分离的菌株进行检测，不能对呼吸道样本、脑脊液、胸水、阳性血培养样本等临床样本进行快速检测。多重实时荧光pcr法(multiplex qpcr，m-qpcr)检测碳青霉烯类耐药基因具有高准确性，可在1.5h内完成检测，但目前商业化试剂盒如美国cepheid公司生产的carba-r价格昂贵。为改进我国诊断、治疗以及感染控制和预防cre感染，建立一种快速、准确检测cp-cre的方法势在必行。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因的引物对组合物。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因的引物对组合物，所述引物对组合物由imp引物对、oxa-48-like引物对、kpc引物对、vim引物对和ndm引物对组成，所述imp引物对由引物imp-f和引物imp-r组成，所述oxa-48-like引物对由引物oxa-48-like-f和引物oxa-48-like-r组成，所述kpc引物对由引物kpc-f和引物kpc-r组成，所述vim引物对由引物vim-f和引物vim-r组成，所述ndm引物对由引物ndm-f和引物ndm-r组成；
4、所述引物imp-f、引物imp-r、引物oxa-48-like-f、引物oxa-48-like-r、引物kpc-f、引物kpc-r、引物vim-f、引物vim-r、引物ndm-f和引物ndm-r为核苷酸序列分别依次是seqid no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq idno.7、seq id no.8、seq idno.10、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.16和seq id no.17的单链dna分子。
5、上文所述imp引物对用于检测所述肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因imp，所述oxa-48-like引物对用于检测所述肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因oxa-48-like，所述基因oxa-48-like编码苯唑西林酶，所述vim引物对用于检测所述肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因vim，所述基因vim编码维罗纳整合子编码的金属β-内酰胺酶，所述kpc引物对用于检测所述肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因kpc，所述基因kpc编码肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶，所述ndm引物对用于检测所述肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因ndm，所述基因ndm编码新德里金属β-内酰胺酶。
6、本专利技术还提供了用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括：探针imp-probe、探针oxa-48-like-probe、探针kpc-probe、探针vim-probe、探针ndm-probe和前述的imp引物对、oxa-48-like引物对、kpc引物对、vim引物对和ndm引物对，所述探针imp-probe、探针oxa-48-like-probe、探针kpc-probe、探针vim-probe和探针ndm-probe的核苷酸序列分别依次是seq idno.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12和seq id no.15。
7、上述引物探针组合物中所述探针imp-probe和探针vim-probe的5’修饰有记荧光基团，3’端修饰有mgb；所述探针oxa-48-like-probe和探针ndm-probe的5'端修饰有vic，3’端修饰有mgb；所述探针kpc-probe的5'端修饰有rox，3’端修饰有mgb。
8、所述荧光基团包括vic、rox或fam。
9、本专利技术还提供用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包含前述的引物对组合物或前述的引物探针组合物。
10、本专利技术还提供了检测检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的方法，所述方法包括使用前述引物探针组合物对待测样品进行pcr扩增反应，根据扩增结果确定待测样品是否含有碳青霉烯耐药基因。
11、上述方法中所述pcr扩增反应为多重实时荧光pcr，所述方法包括以下步骤：
12、a1)提取待测样品dna；
13、a2)将待测样品dna分别加入a体系和b体系进行实时荧光定量pcr反应检测，根据pcr结果确定待测样品是否含有碳青霉烯耐药基因；所述a体系为包含所述imp引物对和所述探针imp-probe、所述oxa-48-like引物对和所述探针oxa-48-like-p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因的引物对组合物，其特征在于，所述引物对组合物由IMP引物对、OXA-48-like引物对、KPC引物对、VIM引物对和NDM引物对组成，所述IMP引物对由引物IMP-F和引物IMP-R组成，所述OXA-48-like引物对由引物OXA-48-like-F和引物OXA-48-like-R组成，所述KPC引物对由引物KPC-F和引物KPC-R组成，所述VIM引物对由引物VIM-F和引物VIM-R组成，所述NDM引物对由引物NDM-F和引物NDM-R组成；
2.用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括：探针IMP-Probe、探针OXA-48-like-Probe、探针KPC-Probe、探针VIM-Probe、探针NDM-Probe和权利要求1中所述的IMP引物对、OXA-48-like引物对、KPC引物对、VIM引物对和NDM引物对，所述探针IMP-Probe、探针OXA-48-like-Probe、探针KPC-Probe、探针VIM-Probe和探针NDM-Probe的核苷酸序列
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针IMP-Probe和探针VIM-Probe的5’修饰有记荧光基团，3’端修饰有MGB；所述探针OXA-48-like-Probe和探针NDM-Probe的5'端修饰有VIC，3’端修饰有MGB；所述探针KPC-Probe的5'端修饰有ROX，3’端修饰有MGB。
4.用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对组合物或权利要求2或3所述的引物探针组合物。
5.检测检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2或3中所述引物探针组合物对待测样品进行PCR扩增反应，根据扩增结果确定待测样品是否含有肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应为多重实时荧光PCR，所述方法包括以下步骤：
7.权利要求1所述的引物对组合物在检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因或制备检测碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的产品中的应用。
8.权利要求1所述的引物对组合物在检测产碳青霉烯酶的碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌或制备检测产碳青霉烯酶的碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的产品中的应用。
9.权利要求1所述的引物对组合物，和/或，权利要求2或3中任一所述的组合物在检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因或制备检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类耐药基因的引物对组合物，其特征在于，所述引物对组合物由imp引物对、oxa-48-like引物对、kpc引物对、vim引物对和ndm引物对组成，所述imp引物对由引物imp-f和引物imp-r组成，所述oxa-48-like引物对由引物oxa-48-like-f和引物oxa-48-like-r组成，所述kpc引物对由引物kpc-f和引物kpc-r组成，所述vim引物对由引物vim-f和引物vim-r组成，所述ndm引物对由引物ndm-f和引物ndm-r组成；
2.用于检测肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括：探针imp-probe、探针oxa-48-like-probe、探针kpc-probe、探针vim-probe、探针ndm-probe和权利要求1中所述的imp引物对、oxa-48-like引物对、kpc引物对、vim引物对和ndm引物对，所述探针imp-probe、探针oxa-48-like-probe、探针kpc-probe、探针vim-probe和探针ndm-probe的核苷酸序列分别依次是seq id no.3、seq id no.6、seqid no.9、seq id no.12和seq idno.15。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针imp-probe...
【专利技术属性】
技术研发人员：隗明，王帅，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：
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