本发明专利技术涉及一种猪蓝耳病病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量ＰＣＲ扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为：５’－ＧＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＡＣ－３’，反向引物的序列为：５’－ＣＧＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＴＧＣＴＴ－３’；所述荧光探针的序列为：５’－ＦＡＭ－ＣＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＣ－ＴＡＭＲＡ－３’。本发明专利技术检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
猪蓝耳病病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，其特征在于标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量ＰＣＲ扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的制备、有效性验证及结果检测判定； （１）标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心ＮＣＢＩ基因库Ｇｅｎｂａｎｋ中检索获得猪蓝耳病病毒的保守基因，基因片段从１１２７１～１１３８７，序列为：ＧＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＰＣＲ反应体系：２５μｌ的阳性对照ＰＣＲ反应体系为含有成分如下：ＤＥＰＣ水，１５．７５μｌ；１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２．５μｌ；１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．５μｌ；１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，０．２５μｌ；３００ｎＭ ＰｒｉｍｅｒＦ，２．５μｌ；３００ｎＭ ＰｒｉｍｅｒＲ，２．５μｌ；感染ＰＲＲＳ猪的ｃＤＮＡ，１μｌ； （ｂ）循环反应： 将加好样的阴性对照和阳性对照的ＰＣＲ试剂管同时放入荧光ＰＣＲ仪中，进行扩增，反应循环程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ，１个循环；９５℃变性２０ｓ、５５℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ，４０个循环后反应结束，得到反应产物； （ｃ）有效性验证： 荧光ＰＣＲ仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照点应无ＣＴ值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其ＣＴ值应＜３２，否则重做。ＧＧＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＣＧ；利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的标准质粒为ＰＵＣ５７，由金斯瑞公司提供合成； （２）特异性引物及荧光探针的设计： 正向引物ＰｒｉｍｅｒＦ：５’－ＧＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＡＣ－３’， 反向引物ＰｒｉｍｅｒＲ：５’－ＣＧＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＴＧＣＴＴ－３’； 荧光探针的序列：５’－ＦＡＭ ＣＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＣ ＴＡＭＲＡ－３’； （３）实时荧光定量ＰＣＲ扩增及建立检测标准曲线，步骤为： （ａ）模板的制备： 定量标准质粒为２．９４×１０９拷贝／μｌ，用稀释液将标准质粒稀释，即稀释成浓度分别为１．０×１０８、１．０×１０７、１．０×１０６、１．０×１０５、１．０×１０４拷贝／μｌ的标准液，标准液在 ２０℃条件下保存备用； （ｂ）实时荧光定量ＰＣＲ扩增： ２５μｌ的ＰＣＲ反应体系含有成分如下：ＤＥＰＣ水，１５．７５μｌ；１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２．５μｌ；１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．５μｌ；１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，０．２５μｌ；３００ｎＭ ＰｒｉｍｅｒＦ，２．５μｌ；３００ｎＭ ＰｒｉｍｅｒＲ，２．５μｌ；模板，１μｌ； 将加样后的ＰＣＲ试剂管放入荧光ＰＣＲ仪中进行扩增，反应循环程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ，１个循环；９５℃变性２０ｓ、５５℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ，４０个循环后，得到反应产物； （ｃ）建立检测标准曲线：荧光ＰＣＲ仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为ｘ轴，ＣＴ值为ｙ轴的标准曲线；（４）有效性验证及结果检测判定，步骤为： （ａ）利用未感染猪蓝耳病病毒ＰＲＲＳ猪的ｃＤＮＡ配制阴性对照ＰＣＲ反应体系：２５μｌ的阴性对照ＰＣＲ反应体系为含有成分如下：ＤＥＰＣ水，１５．７５μｌ；１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２．５μｌ；１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．５μｌ；１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，０．２５μｌ；３００ｎＭ ＰｒｉｍｅｒＦ，２．５μｌ；３００ｎＭ ＰｒｉｍｅｒＲ，２．５μｌ；未感染ＰＲＲＳ猪的ｃＤＮＡ，１μｌ； 利用感染ＰＲＲＳ猪的ｃＤＮＡ制备阳性对照...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈林凤，潘振华，张红，盛青松，
申请(专利权)人：无锡奥瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32
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