【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及色氨酸合酶突变体及在生产半胱氨酸中的应用，属于基因工程和酶工程。
技术介绍
1、l-半胱氨酸和l-胱氨酸是含硫的非必需氨基酸，是组成生命体各种蛋白质的基本单元之一，尤其是在人类和动物的毛发及指爪的角蛋白中含量较高。由于半胱氨酸中的巯基不稳定，极易氧化，两个半胱氨酸分子可由二硫键连接形成一个更稳定的胱氨酸分子。l-半胱氨酸和l-胱氨酸广泛用于医药、食品、化妆品、饲料等的加工制造，尤其可以替代价格更高的甲硫氨酸作为饲料添加剂而使用，因此具有广阔的市场需求和前景。
2、目前，工业生产l-胱氨酸的主要采用毛发水解液提取法、化学合成法和生物法。毛发水解液提取法和化学合成法收率较低，操作步骤多，生产过程会产生大量不易处理的废弃物，造成环境污染，面临较大的环保压力。生物法则具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少、污染小等优点，具有更为广阔的发展潜力。
3、生物法制备半胱氨酸包括体内的微生物发酵法和体外的酶催化转化法。近年来，各国科学家对微生物发酵法合成l-半胱氨酸进行了大量研究，但是限于微生物细胞内代谢网络的复杂性以及不同代谢通路之间的相互影响和制约，目前发酵法生产l-半胱氨酸的产量仍不理想，硫转化率低，尚无法达到工业化生产的要求。酶催化转化法具有专一性强、反应步骤简单、条件温和、环境友好等优点，因而成为人们研究和关注的新方向。
4、酶催化转化法生产l-半胱氨酸，是首先通过工程菌株表达所需催化酶，然后对其进行处理后，将其作为催化剂，在体外催化丝氨酸和硫氢化物反应生成半胱氨酸。如需继续生产
5、色氨酸合酶（tryptophan synthase，trps）是生物体内色氨酸合成途径中的关键酶，由β-亚基（trpb）和α-亚基（trpa）两个亚基组成，催化吲哚与丝氨酸反应合成色氨酸。研究发现，来源于大肠杆菌的色氨酸合酶（ectrps）不仅具有合成色氨酸的功能，还能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成半胱氨酸，这为半胱氨酸的酶催化生产开辟了新思路。但是，对ectrps的研究多聚焦于其在细胞内所参与的色氨酸合成和代谢途径，鲜少有人关注其半胱氨酸合成的能力。目前以ectrps酶催化生成半胱氨酸过程中，半胱氨酸的产量和转化率仍然不高，因而导致生产成本无法进一步下降。近年来，各行业对l-半胱氨酸需求量日益增加，而现有产量远不能满足国内外市场的需求。因此，通过对色氨酸合酶ectrps进行分子改造，对提高半胱氨酸的产量和转化率、降低成本具有重要意义。
技术实现思路
1、为了提高酶催化法生产l-胱氨酸过程中的产量和底物转化率，同时也为了减少产品中杂质含量，本专利技术对来源于大肠杆菌的色氨酸合酶ectrps进行突变和筛选，得到具有催化丝氨酸和硫氢化钠合成l-半胱氨酸的高酶活性的ectrps突变体（本专利技术后述所涉及酶活、酶活性、反应酶活、酶功能、催化功能等或具有相同含义的类似表述，如未特殊说明，均指催化丝氨酸和硫氢化钠合成l-半胱氨酸的活性或功能）。
2、本专利技术的目的是提供一种新型的色氨酸合酶突变体及其在生产半胱氨酸中的应用。
3、为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种色氨酸合酶突变体，其是对来源于大肠杆菌（ escherichia coli）的ectrps进行氨基酸取代的突变而得到的，所述突变体由α-亚基和β-亚基组成，其中α-亚基的氨基酸序列如seq id no：2所示，β-亚基是以seq id no：1所示的氨基酸序列为基础，进行选自如下位点的突变而得到的：
4、1）第36-40位氨基酸由qkdpe到aaapa的突变；
5、2）第47位氨基酸由d到w或r的突变；
6、3）第64位氨基酸由n到w的突变；
7、4）第127位氨基酸由g到r的突变；
8、5）第143位氨基酸由s到w或r的突变；
9、6）第170位氨基酸由c到a的突变；
10、7）第246位氨基酸由n到a的突变；
11、本专利技术提供编码所述色氨酸合酶突变体的核酸分子。
12、本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
13、本专利技术提供一种重组微生物，所述重组微生物是将编码所述色氨酸合酶突变体的核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌为宿主细胞，在该重组细胞中表达了色氨酸合酶突变体。
15、本专利技术提供所述色氨酸合酶突变体或所述生物材料或所述重组微生物在半胱氨酸生产中的应用。
16、所述重组微生物可以是以大肠杆菌为宿主细胞，在该重组细胞中表达所述色氨酸合酶突变体。
17、所述大肠杆菌菌株可以是基因工程领域常用的工程菌株，优选例如bl21(de3)、bw25113、w3110、w3110(de3)、m5 hiper blr(de3)、bl21(de3)duos，特别优选大肠杆菌bl21(de3)。
18、本专利技术提供一种l-半胱氨酸的制备方法，其特征在于使用所述色氨酸合酶突变体、编码所述色氨酸合酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料。
19、所述l-半胱氨酸的制备方法，以丝氨酸和硫氢化钠为底物，使底物与所述突变体接触，酶催化合成l-半胱氨酸。
20、在本专利技术的一种实施方式中，培养表达所述色氨酸合酶突变体的重组大肠杆菌细胞，高压破碎所述重组细胞后获得的突变体细胞破碎液作为反应酶液，加入反应液中进行酶催化反应。
21、在本专利技术的一个具体实施方式中，酶催化反应体系包括：l-丝氨酸、硫氢化钠、磷酸吡哆醛、磷酸氢二钠、突变体细胞破碎液。
22、所述酶催化反应体系如下：l-丝氨酸0.5-2 m、硫氢化钠0.5-2 m、磷酸吡哆醛0.1-1 mm、磷酸氢二钠20-100 mm，和相当于10-50 g/l湿菌体的突变体细胞破碎液。
23、所述相当于10-50 g/l湿菌体的突变体细胞破碎液，意思是在每升酶催化反应体系中含有由10-50g表达突变体的细胞湿菌体经高压破碎后得到的细胞破碎液。
24、上述方法，酶催化反应条件为：30-45 ℃、ph 7.5-8.5。
25、本专利技术提供一种l-胱氨酸的制备方法，将上述方法制备得到的l-半胱氨酸氧化得到l-丝氨酸。
26、本专利技术提供一种l-半胱氨酸或l-胱氨酸的制备方法，其具体包括如下步骤：
27、（1）培养表达所述色氨酸合酶突变体的重组大肠杆菌细胞；
28、（2）对培养物进行细胞破碎处理，所得细胞破碎物即为含本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种色氨酸合酶突变体，其特征在于，由α-亚基和β-亚基组成，其中α-亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，β-亚基是以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为基础，进行选自如下位点的突变：第64位N突变为W、第127位G突变为R或第36-40位QKDPE突变为AAAPA。
2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.重组微生物，其特征在于，所述重组微生物是将权利要求2所述核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
5.权利要求1所述突变体或权利要求3所述生物材料或权利要求4所述重组微生物在L-半胱氨酸或L-胱氨酸生产中的应用。
6.一种L-半胱氨酸或L-胱氨酸的制备方法，其特征在于，使用如权利要求1所述突变体或权利要求3所述生物材料或权利要求4所述重组微生物。
7.如权利要求6所述的L-半胱氨酸或L-胱氨酸的制备方法，其特征在于，以
8.一种如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于步骤（3）的催化反应体系包括: L-丝氨酸、硫氢化钠、磷酸吡哆醛、磷酸氢二钠、如权利要求4所述的重组微生物的细胞破碎液。
10.如权利要求7-9任意一项所述的制备方法,其特征在于所述L-丝氨酸为L-丝氨酸纯品或将丝氨酸生产菌发酵得到的L-丝氨酸发酵液。
...【技术特征摘要】
1.一种色氨酸合酶突变体，其特征在于，由α-亚基和β-亚基组成，其中α-亚基的氨基酸序列如seq id no：2所示，β-亚基是以seq id no：1所示的氨基酸序列为基础，进行选自如下位点的突变：第64位n突变为w、第127位g突变为r或第36-40位qkdpe突变为aaapa。
2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.重组微生物，其特征在于，所述重组微生物是将权利要求2所述核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
5.权利要求1所述突变体或权利要求3所述生物材料或权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：林振泉，乔玮博，马成伟，刘云慧，金祥，
申请(专利权)人：北京量维生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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