【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原体检测。更具体地，涉及一种人巨细胞病毒核酸的定量检测试剂盒。
技术介绍
1、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)又称细胞包涵体病毒，因其感染的细胞在光学显微镜下可见细胞增大，有包涵体形成而得名。人巨细胞病毒在人群中的感染非常广泛，一般以潜伏感染的形式存在。当感染者自身免疫功能低下或缺失时，潜在的hcmv才会复活增殖，表现出明显的临床症状。hcmv感染可引起视网膜炎、肺炎、脑炎、肝炎、卵巢炎、宫颈癌、前列腺癌等。孕妇感染hcmv可导致胎儿肝脾肿大、血小板减少性人巨细胞病毒紫癫及溶血性贫血，少数还会出现先天性畸形、智力低下、神经肌肉运动障碍、耳聋、脉络膜视网膜炎等。因此，需对人巨细胞病毒进行灵敏的定性和准确的定量检测，以监测人巨细胞病毒的感染情况，以便及时干预或治疗，避免人巨细胞病毒相关疾病的发生与进一步发展。
2、目前，hcmv的检测技术已从生物学病毒分离和免疫学检测进入到基于核酸(dna)进行诊断的分子生物学阶段。常规的hcmv dna的检测主要依赖于pcr检测技术。传统的pcr技术需采用凝胶电泳法对pcr产物进行分析，只能定性分析，还具有操作繁琐、易污染环境且对人体有害等缺点。实时荧光定量pcr虽避免了传统pcr的缺陷，但其核酸定量需依赖标准曲线，灵敏度、精确度和分辨率易受限制。“第三代pcr”分析技术，即数字pcr(digitalpcr，dpcr)技术克服了实时荧光pcr依赖标准曲线、定量结果不直观等的缺陷，实现了核酸分子的绝对定量。现虽已有少量基于数字pcr对h
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术中存在的问题，基于数字pcr技术提供了一种用于检测人巨细胞病毒的引物和探针组合，并在此基础上提供了一种人巨细胞病毒核酸的定量检测试剂盒，其对人巨细胞病毒核酸的检测限为150copies/ml。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测人巨细胞病毒的引物和探针组合。
3、本专利技术的第二个目的是提供所述引物和探针组合在制备用于检测人巨细胞病毒的产品中的应用。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种人巨细胞病毒核酸的定量检测试剂盒。
5、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
6、本专利技术比对分析了不同来源的人巨细胞病毒(hcmv)的序列，基于序列的分析比对结果，设计、优化得到了一种用于检测人巨细胞病毒的引物和探针组合。在所述引物和探针组合的基础上，本专利技术还提供了一种人巨细胞病毒核酸的定量检测试剂盒，结合数字pcr检测平台，实现了对hcmv灵敏、特异、准确的检测，检测限为150copies/ml，定量准确性好。因此，本专利技术请求保护所述引物和探针组合及试剂盒。
7、本专利技术提供了一种用于检测人巨细胞病毒的引物和探针组合，包括用于检测人巨细胞病毒的数字pcr引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
8、进一步地，所述引物和探针组合还包括用于检测内标gapdh的数字pcr引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3～4所示；所述探针的核苷酸序列如seq idno.6所示。
9、具体地，所述引物和探针组合中的探针的5’端标记有不同的荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
10、作为其中一种可选的实施方式，seq id no.5所示探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团mgb；seq id no.6所示探针的5’端标记有荧光基团vic，3’端标记有淬灭基团mgb。
11、利用本专利技术所述引物和探针组合，可以实现对人巨细胞病毒的定性和定量检测。因此，本专利技术还请求保护所述引物和探针组合在制备用于检测人巨细胞病毒的产品中的应用。
12、具体地，所述产品为用于定性或定量检测人巨细胞病毒的产品。
13、本专利技术还提供了一种人巨细胞病毒核酸的定量检测试剂盒，含有引物探针预混液和数字pcr反应所需试剂；所述引物探针预混液中含有本专利技术所述引物和探针组合。
14、具体地，所述数字pcr反应所需试剂为微滴式数字pcr反应所需试剂。
15、具体地，配制引物探针预混液所用试剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
16、本专利技术所述试剂盒中还含有阳性质控品和阴性质控品。
17、具体地，所述阳性质控品中含有所检测的人巨细胞病毒的基因片段和内标基因片段；所述阴性质控品中含有所检测的内标基因片段。
18、可选地，所述阳性质控品为含有所检测的人巨细胞病毒的基因片段和内标基因片段的重组质粒或假病毒。
19、可选地，所述阴性质控品为仅含内标基因序列的重组质粒或假病毒，或te溶液。
20、本专利技术还提供了一种利用本专利技术所述试剂盒定量检测人巨细胞病毒核酸的方法，包括以下步骤：
21、s1.提取待测样本核酸；
22、s2.以s1所得样本核酸为模板，配制数字pcr反应体系；
23、s3.数字pcr检测。
24、可选地，所述样本为血清或血浆。
25、具体地，配制反应体系所用试剂除引物探针预混液外，还有适用于dna样本的微滴式数字pcr预混液。
26、可选地，所述预混液为ddpcrtm supermix for probes(no dutp)，购自bio-rad公司。
27、具体地，反应体系(单人份)为：6μl引物探针预混液，11μl ddpcrtm supermix forprobes(no dutp)和5μl样本核酸(或阳性质控品/阴性质控品)。
28、所述反应体系中，人巨细胞病毒检测和内标检测上下游引物的终浓度范围为0.4～0.5μmol/l，人巨细胞病毒检测和内标检测的探针的终浓度范围为0.2～0.25μmol/l。
29、当人巨细胞病毒检测和内标检测上下游引物的终浓度为0.455μmol/l，人巨细胞病毒检测和内标检测探针的终浓度为0.227μmol/l时，检测效果相对最好。
30、具体地，循环条件为：95℃10min；94℃30s，55℃1min 30s，40个循环；98℃10min；4℃保存。选择fam通道检测人巨细胞病毒核酸，选择vic通道检测内标。
31、具体地，本专利技术所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测所有反应孔中只有微滴数≥10000的反应孔为有效反应孔。有效反应孔中，应包含阴性对照组和阳性对照组，当阳性对照组检测结果为阳性，阴性对照组检测结果为阴性，且阳性对照组的浓度检测结果为105±10％copies/ml时，本次检测结果有效。
32、本专利技术具有以下有益效果：
33、本专利技术基于对人巨细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测人巨细胞病毒的引物和探针组合，其特征在于，包括用于检测人巨细胞病毒的数字PCR引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述引物和探针组合，其特征在于，还包括用于检测内标GAPDH的数字PCR引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有不同的荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述引物和探针组合，其特征在于，SEQ ID NO.5所示探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团MGB；SEQ ID NO.6所示探针的5’端标记有荧光基团VIC，3’端标记有淬灭基团MGB。
5.权利要求1～4任一所述引物和探针组合在制备用于检测人巨细胞病毒的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述产品为用于定性或定量检测人巨细胞病毒的
7.一种人巨细胞病毒核酸的定量检测试剂盒，其特征在于，含有引物探针预混液和数字PCR反应所需试剂；所述引物探针预混液中含有权利要求1～4任一所述引物和探针组合。
8.根据权利要求7所述定量检测试剂盒，其特征在于，还含有阳性质控品和阴性质控品。
9.根据权利要求7所述定量检测试剂盒，其特征在于，配制引物探针预混液所用试剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
10.根据权利要求8所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有所检测的人巨细胞病毒的基因片段和内标基因片段；所述阴性质控品中含有所检测的内标基因片段。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测人巨细胞病毒的引物和探针组合，其特征在于，包括用于检测人巨细胞病毒的数字pcr引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
2.根据权利要求1所述引物和探针组合，其特征在于，还包括用于检测内标gapdh的数字pcr引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3～4所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no.6所示。
3.根据权利要求2所述引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有不同的荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述引物和探针组合，其特征在于，seq id no.5所示探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团mgb；seq id no.6所示探针的5’端标记有荧光基团vic，3’端标...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，王世东，陈书容，杨晓雯，黄志文，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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