本发明专利技术提供了一种菊糖芽孢乳杆菌以及采用该菌株发酵制备Ｄ－乳酸的方法，用于本发明专利技术的菌株为菊糖芽孢乳杆菌（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ?ｉｎｕｌｉｎｕｓ）ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．３９９７，发酵生产Ｄ－乳酸的方法，包括（１）发酵种子的培养步骤、（２）Ｄ－乳酸发酵步骤和（３）提取和精制Ｄ－乳酸步骤。本发明专利技术的菌株，具有稳定的高产性能和高光学纯度特点，发酵配方来源广泛，价格低廉，发酵状态介于厌氧和微氧之间，菌株发酵周期４０－５０小时，发酵产酸１２－１４％，糖酸转化率在９２％－９４％，发酵光学纯度９８－９９％。在提取和纯化方面采用了一系列当今较为先进的膜技术和短程蒸馏技术，确保了产品质量和提取收率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制备D-乳酸的方法。 本专利技术涉及一种工业化生产高纯度聚合级D-乳酸的工艺路线，它包含专用菌种、种子和发酵培养基配方，发酵工艺和提取纯化工艺，属于有机酸生物炼制领域。
技术介绍
乳酸(Lactic Acid)是一种重要的有机酸，它在食品、饮料、饲料、现代医药、现代农药、日用化工、造纸及电子等行业具有广泛的应用前景。根据乳酸的旋光性质可分为L-乳酸、DL-乳酸和D-乳酸。近年来，人们以L-乳酸为原料，制成可生物降解的新型环保材料-聚乳酸(PLA)。在全球变暖、石油紧缺、原油价格剧烈波动的大环境下，再生资源特别是生物降解材料受到了更大的关注。其中，聚乳酸材料是第一个形成商业化规模的降解材料，被认为是最有市场价值的可降解新材料。目前开发聚乳酸主要由L-乳酸制备而来，所制备的L型聚乳酸称为PLLA，由于受其性能影响，目前主要应用于普通包装材料和热塑制品。随着D型聚乳酸(PDLA)技术的开发，通过对PLLA中加入一定量的PDLA共混，可形成高结晶性的立构聚乳酸(scPLA)，有更高的溶解温度(230℃，普通聚乳酸为180℃)和更好的机械性能，scPLA可用于高附加值工程塑料应用领域和改善PLA性能拓展其应用领域。在2008年前国际上工业级D-乳酸还未形成产业化，少量的中试D-乳酸产品价格在10～30万元/吨，国内目前还没有提供高品质聚合级D型乳酸产品的生产单位。 在聚乳酸材料开发之前，D-乳酸的研究未被重视，随着D-乳酸产品应用价值的发现，促进了D-乳酸生产研究的开展。生产乳酸的方法主要有化学合成法和发酵法。其 中化学合成法只能合成DL-乳酸，若要得到L型和D型乳酸还需进行光学拆分，而且合成法原料来自于石油副产物，具有毒性，所以在日常生产中一般不被接受。微生物发酵乳酸以淀粉糖为原料，来源广泛，生产安全性好，成本低，是乳酸主要的生产方式。 国内有关D-乳酸研究报道较少，南京工业大学丁子建等于2004年首次报道利用芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)从葡萄糖发酵产D-乳酸的工艺，发酵72小时后产酸40.7g/L，光学纯度96.04％；南京工业大学杨文革等在2006年发表组合发酵生产D-乳酸工艺(中国专利申请号200610097453.6)以乳酸杆菌(Lactobacillus)进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵技术，发酵时间25-38h，产酸达到7.5-13.1％；中国科学院微生物研究所许平等在2007年发表半连续法发酵生产D-乳酸工艺中国专利申请号200710176056.2。 上述公开的技术，由于主要局限于菌种和局部发酵条件的探索等原因，未深入涉及到工业化生产工艺以及D-乳酸的提取纯化技术的开发，与工业化有较大距离，所以目前均未能工业化实施。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种菊糖芽孢乳杆菌以及采用该菌株发酵制备D-乳酸的方法，以实现工业化发酵生产D-乳酸。--> 用于生产本专利技术的D-乳酸的微生物-菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)为一种属于芽孢乳杆菌属的菌种，进一步鉴定种名为菊糖芽孢乳杆菌，该菌种从东北菊糖厂粗制菊糖粉中分离而得，其于2010年7月7日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 邮编：100101)，保藏号为CGMCC No.3997。 所述的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)具有下述性质： 1)形态特征：杆状、单个或成对，形成内生孢子，少量周生鞭毛，运动。 在含有葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨的琼脂平板上形成细小的针状菌落。 2)生理生化特征：革兰氏阳性，微耗氧。不形成吲哚，不液化明胶，不还原硝酸盐，石蕊牛奶不变。 能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖产酸，不能利用木糖、半乳糖、阿拉伯糖产酸。 10℃以下和45℃以上不生长，最适生长温度35-40℃。 根据东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社2001)报道的方法进行鉴定，所述的菌种属于芽孢乳杆菌属的菌种，但是，又与“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中菊糖芽孢乳乳杆菌有明显区别，其“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中菊糖芽孢乳乳杆菌与菊糖芽孢乳杆菌形态和生理生化特征比较如表1所示： 表1--> 所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)的筛选方法： (1)采集来自菊糖厂粗制菊糖粉，称取5g菊糖粉溶于100mL生理盐水，充分混匀后取1mL至9mL无菌水中，摇匀制成10-1稀释液。重复上述步骤制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液，取10-3、10-4、10-5稀释液0.1-0.2mL涂布于MRS固体培养基上，37℃培养；菌落长出后，挑-->取能将周围培养基的碳酸钙溶解而形成透明圈明显的单菌落，接种于25mL发酵培养基中，38℃静止培养72hr后，根据上述具体实施方式中所述的检测方法，检测发酵液中D-乳酸含量。经过多次筛选，挑出一株D-乳酸产量最高的菌株； (2)菌株诱变筛选 采用化学诱变剂亚硝基胍处理上述获得的D-乳酸产量最高的菌株后，在添加乳酸钠(相当于8.0％-10％乳酸)的MRS培养基中进行37℃培养，共得到324株耐受产物乳酸能力增长的突变型。最后，对发酵培养基进行优化并对20株产量正突变株的发酵产物进行定量测定。经传代发酵试验，即可获得本专利技术的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)高产变异株。 采用所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤： (1)发酵种子的培养： 在无菌室内，将试管斜面培养的菊糖芽孢乳杆菌接种到三角玻璃培养瓶内，以葡萄 糖为碳源，进行厌氧培养，并加入碳酸钙，将瓶口用绒布和牛皮纸二层扎紧封口，在箱式摇床上进行培养，培养温度在35-45℃，pH控制在5-6，培养时间在15-20小时； 然后将上述培养后的产物，以葡萄糖为碳源，配制种子培养基，糖的质量浓度为4％-5％，培养温度为35-45℃，pH为5-6的条件下进行种子罐种子培养，中和剂选用轻质碳酸钙，前期通入氮气在0.1-0.05Mpa罐压下，接入摇瓶种子进行种子罐种子培养，培养时间在15-20小时，培养中后期转化为微氧培养，种子罐可以是一级培养也可以二级或三级培养。 上述的发酵种子的培养为一种常规的方法，培养基等为无特殊的要求，具体的过程，可参见Kosaki.M.：Production of high optical purity D-lactic acid(P).US5466588，1995-11-14文献报道的方法； (2)D-乳酸发酵： 将步骤(1)培养好的种子接种于发酵培养基上，接种量为3％-8％(v/v)，培养温度为35-45℃，pH为5-6，发酵采用交替批式培养，从开始培养至6小时之间，利用自身排出的二氧化碳气体作为厌氧环境，为厌氧发酵，6-30小时之间为微氧发酵，30小时至培养结束利用自身排出的二氧化碳气体作为厌氧环境，为厌氧发酵，发酵周期为40-50小时，获得含有D-乳酸的发酵醪液； 所述微氧发酵时，通入空气，空本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CGMCC No.3997。2.采用权利要求1所述的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CGMCC No.3997发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，包括(1)发酵种子的培养步骤、(2)D-乳酸发酵步骤和(3)提取和精制D-乳酸步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将步骤(1)培养好的种子接种于发酵培养基上，接种量为3％-8％(v/v)，培养温度为35-45℃，pH为5-6，发酵采用交替批式培养，从开始培养至6小时之间，利用自身排出的二氧化碳气体作为厌氧环境，为厌氧发酵，6-30小时之间为微氧发酵，30小时至培养结束利用自身排出的二氧化碳气体作为厌氧环境，为厌氧发酵，发酵周期为40-50小时，获得含有D-乳酸的发酵醪液，然后从发酵醪液中，提取和精制D-乳酸。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，微氧发酵时，通入空气，空气通入量采用氧化还原电位和二氧化碳变化进行控制，氧化还原电位为-150～-180，尾气二氧化碳含量在15-20％。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，提取和精制D-乳酸，包括如下步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱志良，劳含章，沈永喜，雷肇祖，孙建荣，潘荣华，
申请(专利权)人：上海新立工业微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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