【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体而言，涉及一种高耐热型腈水合酶突变体及其应用。
技术介绍
1、腈水合酶(nitrile hydratase，简称nhase，ec 4.2.1.84)，可以将腈类底物水合，从而转化为相应的酰胺类产物。玫瑰色红球菌j1(节杆菌属)来源的该酶是人们首次发现并报道的腈水合酶[1]。目前生产腈水合酶的微生物有红球菌属(rhodococccus)、假单胞菌属(pseudomonas)和短杆菌属(brevibacterium)等，且其异源表达已在大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、毕赤酵母(pichiapastoris)等模式菌株中实现。随着对腈水合酶研究的深入，条件温和、选择性强的生物催化法正逐步替代化学合成法，成功应用于工业生产丙烯酰胺、烟酰胺和5-氰基戊酰胺等酰胺类产品。
2、酰胺类化合物具有较高的商业价值，有许多具有代表性的产品。丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的前体，聚丙烯酰胺可用作絮凝剂(废水处理)、土壤改良剂(减轻土壤侵蚀)、原料添加剂(造纸和纸浆工业)以及石油工业(提高石油采收率)。丙烯酰胺还可应用到塑料生产、食品加工，也可用作粘合剂和化妆品添加剂。然而，目前腈水合酶的工业应用仍然存在一定的问题。由于腈的水合是放热反应，这就要求腈水合酶具有较好的热稳定性才能在高温下维持高反应速率。因此，获取兼具较高酶活和良好热稳定性的腈水合酶具有重要意义。
3、嗜热假诺卡氏菌pseudonocardia thermophi
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种高耐热型腈水合酶突变体，以解决腈水合酶的热稳定性一般，且常规嗜热假诺卡氏菌对温度的耐受性较差的问题。
2、为解决上述问题，本专利技术提供了一种高耐热型腈水合酶突变体，所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如seq id no.1、seq idno.2以及seq id no.3所示的氨基酸序列。
3、本专利技术还包括一种编码所述腈水合酶突变体的基因。
4、本专利技术还包括一种所述基因的重组载体。
5、本专利技术还包括一种表达所述腈水合酶的细胞。
6、作为优选的方案，所述细胞包括大肠杆菌。
7、作为优选的方案，所述细胞是以大肠杆菌bl21为宿主，以pet-系列质粒为载体的细胞。
8、作为优选的方案，所述质粒为pet-24(+)。
9、本专利技术还包括一种提高腈水合酶热稳定性的方法，所述方法是将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶β亚基第46位甲硫氨酸突变为丙氨酸。
10、本专利技术还包括一种生产腈水合酶的方法，所述方法将表达所述腈水合酶突变体的细胞接种于lb培养基中，37℃培养至od600为0.6-0.8时，加入诱导剂iptg于24℃诱导12-16h。
11、作为优选的方案，具体方法为采用同源重组的方法构建包含上述3段氨基酸基序的突变体质粒，在宿主中表达后，通过纯化得到突变体的纯酶，测定热处理前后的比酶活和相对残余酶活并与野生酶进行比较。
12、本专利技术还包括所述的腈水合酶突变体或所述的细胞在生产含丙烯酰胺的产品中的应用。
13、作为优选的方案，所述应用具体包括通过5l发酵罐培养验证及全细胞催化计算转化效率和产率。
14、上述的5l发酵罐培养，是获得腈水合酶的一种方法：酶需要通过微生物发酵产生，5l发酵罐是培养含有腈水合酶的菌体，如果只得到菌体，即为全细胞，如果把菌体中的腈水合酶提取纯化出来，就是纯酶。
15、相较于现有技术而言，本专利技术至少具备以下的技术进步：
16、本专利技术提供了一段ptnhase的氨基酸基序及突变体的氨基酸基序，该基序与其他来源的腈水合酶基序在α亚基上酶活中心的108、111和113位点均是高度保守的，它们分别与钴离子形成配位键。同时，进一步说明了上述腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的46号位单点突变体(m46a)在腈水合酶生物催化和工业生产上的应用。当对该位点进行突变构建单点突变体时，m46a的比酶活为965.72±79.6u/mg，65℃热处理下半衰期为180.34±1.94min。而野生型腈水合酶的比酶活1331.44±35.5u/mg，65℃热处理下半衰期只有75.29±11.59min。其中突变体m46a的熔融温度(tm)比野生型高3.62℃。氨基酸残基的突变显著改善了腈水合酶的热稳定性，有利于应用于工业上高附加值化学品如丙烯酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。
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1.一种高耐热型腈水合酶突变体，其特征在于：所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。
3.一种含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.一种表达权利要求1所述腈水合酶的细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌。
6.根据权利要求4或5所述的细胞，其特征在于，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET-系列质粒为载体的细胞。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述质粒为pET-24(+)。
8.一种提高腈水合酶热稳定性的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第46位甲硫氨酸突变为丙氨酸。
9.一种权利要求1所述生产腈水合酶突变体的方法，其特征在于，将表达所述腈水合酶突变体的细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，
10.权利要求1所述的腈水合酶突变体或权利要求4所述的细胞在生产含丙烯酰胺的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高耐热型腈水合酶突变体，其特征在于：所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如seq id no.1、seq id no.2以及seq idno.3所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。
3.一种含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.一种表达权利要求1所述腈水合酶的细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌。
6.根据权利要求4或5所述的细胞，其特征在于，所述细胞是以大肠杆菌bl21为宿主，以pet-系...
【专利技术属性】
技术研发人员：马骏，吴丛伟，余亮，张虎寅，
申请(专利权)人：浙江鑫甬生物化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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