【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学，涉及一组富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，本专利技术同时还涉及该抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。
技术介绍
1、抗生素的出现挽救了无数人的生命，为人类的医疗事业做出了巨大的贡献。但由于抗生素大多在细菌的特定部位发挥作用，因此抗生素靶点的微小变化就足以阻止药物发挥作用，从而产生耐药性。目前，由于抗生素的滥用与误用，抗生素耐药性已成为世界卫生组织报告的三大公共卫生威胁之一，因此，开发新型抗菌剂已成为一项紧迫的任务(marston,dixon et al.2016)。
2、抗菌肽由于其良好的生物相容性和不易产生耐药性的特点可作为理想的抗生素候选物或抗生素佐剂而引起了广泛关注。与抗生素干扰病原微生物的代谢过程不同，抗菌肽通常通过物理破坏微生物脂质双层并导致细胞内容物泄漏来产生抗菌效果。此外，抗菌肽还可作用于细菌体内的多个靶点，因此细菌体内任何一靶点的改变，都不会使其产生明显的耐药性。基于抗菌肽广谱的抗菌活性及其独特的作用方式，越来越多的研究者投入到抗菌肽的人工合成研究中，且部分抗菌肽已被应用于临床治疗中(wang,dou et al.2018)。
3、在人工合成抗菌肽中，一些氨基酸对抗菌肽的活性发挥着重要作用，例如色氨酸和精氨酸在许多抗菌肽中反复出现，并发挥着重要的作用(zhu,akhtar et al.2022)。精氨酸带有的正电荷可以介导抗菌肽与细菌带负电的细胞膜或细胞壁产生相互作用，精氨酸的胍基还能与脂质头基的磷酸部分形成强的双齿氢键，从而促进膜的深入插入，使抗菌肽具有更强的膜破坏能
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽。
2、本专利技术的目的之二是提供上述抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。
3、为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、(一)富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽的设计
5、本专利技术以yrα(yrε)kxw-nh2为结构通式，其中y代表赖氨酸两个氨基端所连精氨酸的数目，x为赖氨酸羧基端所连色氨酸的数目，括号代表氨基酸连接到赖氨酸侧链的氨基上。当y＝2,x＝4时，为抗菌肽2rα(2rε)4w，其氨基酸序列为rr(rr)kwwww-nh2。当亲脂性氨基酸和亲水性氨基酸位置变化时，得到抗菌肽2wα(2wε)4r，其氨基酸序列为ww(ww)krrrr-nh2。与2rα(2rε)4w相对应的线性肽结构式为r4kw4，其氨基酸序列为rrrrkwwww-nh2。与2wα(2wε)4r相对应的线性肽结构式为w4kr4，其氨基酸序列为wwwwkrrrr-nh2。
6、(二)富含精氨酸和色氨酸的树状聚合抗菌短肽的合成
7、本专利技术富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，是以rink-mbha resin为原料，采用经典的多肽fmoc固相合成方法合成的。在多肽合成过程中以hobt/hbtu为缩合剂进行氨基酸耦合，采用茚三酮显色法检定二级胺，按照多肽序列依次耦合即得连有mbha树脂的多肽，多肽切割及hplc纯化后得到。
8、(三)富含精氨酸和色氨酸的树状聚合抗菌短肽的应用
9、1、体外抑菌实验
10、采用经典的微量连续二倍稀释法测定抗菌肽对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌)的最小抑菌浓度(mic)。以抗生素rifampin、vancomycin、polymyxin b作为阳性对照，结果见表1。
11、表1本专利技术抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度
12、
13、
14、表1结果显示，本专利技术抗菌肽对革兰氏阳性菌(黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)具有较强的抑制活性，对部分的革兰氏阴性菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)也有较好的抑制作用。
15、2、溶血活性实验
16、为了考察本专利技术合成的抗菌肽对正常哺乳动物细胞的毒性，我们测定了肽2rα(2rε)4w、2wα(2wε)4r、r4kw4和w4kr4与小鼠红细胞孵育1h后的溶血情况，结果见图5。
17、图5结果显示，这几条抗菌肽在256μm的浓度下与小鼠红细胞孵育1h之后溶血率低于10％，远远高于抗菌肽发挥抗菌活性的浓度，表明这些抗菌肽具有较高的生物相容性。
18、3、细胞毒性实验
19、由于多肽抗菌药物通常对细胞具有较大的毒性，为了进一步考察本专利技术合成的抗菌肽对正常细胞的毒性，我们测定了肽2rα(2rε)4w、2wα(2wε)4r、r4kw4和w4kr4分别与人胚胎肾细胞293(hek293t)孵育1h后的细胞毒性，结果见图6。
20、图6结果显示，肽2rα(2rε)4w、2wα(2wε)4r、r4kw4和w4kr4在最大测试浓度下(128μm)均未导致半数的细胞致死，这表明这些抗菌肽具有较低的细胞毒性。
21、4、稳定性实验
22、由于抗菌肽的稳定性对其体内活性具有很大影响，为了考察本专利技术合成的抗菌肽对肽酶的稳定性，我们测定了肽2rα(2rε)4w、2wα(2wε)4r、r4kw4和w4kr4分别与不同浓度的胰酶和糜酶孵育6h后对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，结果见图7、8。
23、图7、8结果显示，树状聚合肽2rα(2rε)4w表现出最强的酶解稳定性，分别在最大胰酶浓度200μg/ml下和最大糜酶浓度20μg/ml下对金黄色葡萄球菌25923具有较强的抗菌活性，其线性肽r4kw4表现出抗菌活性的最大胰酶浓度和糜酶浓度分别为0.2μg/ml和2μg/ml。树状聚合肽2rα(2rε)4w与线性结构相比对胰酶和糜酶的稳定性分别提高了103和10倍，这说明分支结构所产生的空间位阻能有效限制肽酶切割，提高酶解稳定性。此外，树状聚合肽2rα(2rε)4w的胰酶和糜酶稳定性分别是2wα(2wε)4r的103和10倍，这是因为酶选择性切割位于c端的碱性氨基酸，因此精氨酸(r)排列在肽链n端且形成分支结构的肽2rα(2rε)4w具有最好的酶解稳定性。由于2wα(2wε)4r和其线性肽w4kr4的r均线性排列在肽链c端，因此并未表现出更好的稳定性。
24、上述研究表明树状聚合肽2rα(2rε)4w表现出良好的抗菌活性和生物相容性，以及最好的的酶解稳定性，因此后续对树状聚合肽2rα(2rε)4w进行了耐药性以及体内安全性和有效性的测定，并将其线性肽r4kw4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽分为树状聚合肽和线性肽；
2.如权利要求1所述的一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽为树状聚合肽2Rα(2Rε)4W或对应的线性肽R4KW4。
3.如权利要求2所述的一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽为树状聚合肽2Rα(2Rε)4W。
4.如权利要求1-3任一项所述的一类富含精氨酸和色氨酸抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。
5.如权利要求4所述的一类富含精氨酸和色氨酸抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，所述抗菌短肽抗菌菌种为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
6.如权利要求5所述的一类富含精氨酸和色氨酸抗菌短肽在制备治疗大肠杆菌诱导的细菌性肺炎药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽分为树状聚合肽和线性肽；
2.如权利要求1所述的一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽为树状聚合肽2rα(2rε)4w或对应的线性肽r4kw4。
3.如权利要求2所述的一类富含精氨酸和色氨酸的抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽为树状聚合肽2rα(2rε)4w。
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