【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种生产丙二酸的重组大肠杆菌及其制备方法与应用。
技术介绍
1、丙二酸含有活泼的亚甲基，是一种重要的有机合成中间体，目前主要用于香料和医药中间体，尤其是在医药工业中，用于生产巴比妥酸、维生素b1，维生素b2等。另外还可以应用于胶粘剂和树脂添加剂等的生产，也可用于皮革制品或铝制品表面处理剂、泡沫塑料发泡剂和核反应器的化学清洗剂。其下游产品覆盖面非常大，涉及到塑料、染料、医药、农药、电镀等行业。随着目前国内和国际化工行业的快速发展，加上丙二酸的用途的大力开发，丙二酸的产量和品质在日剧上升。
2、丙二酸现在应用于实际生产中的主要合成方法为化学合成法。主要有两种生产路线，一是丙二酸酯在80-90℃下通过硫酸水解，该法特点是工艺路线及生产周期短、三废少，但该水解过程属于可逆反应，且丙二酸受高温容易发生脱羧反应分解生成乙酸、水和二氧化碳，故产品收率低；二是酯交换工艺，但该工艺需要用到乙酸、有刺鼻酸味、另有副产乙酸乙酯和乙醇的混合溶液产生，不好处理。
3、目前，已有研究机构开始研究丙二酸的生物合成途径，如通过基因工程改造大肠杆菌，在胞内构建了丙二酸生物合成途径。但目前的研究主要集中在丙二酸途径的构建，而在这一过程中，碳流失比较严重，导致原料利用率低，且改造后的菌株在发酵过程中会产生乳酸、乙酸、甲酸等杂质，影响产量的同时，增加了后期分离纯化的难度。
技术实现思路
1、因此，本专利技术主要针对丙二酸生物合成过程中碳流失严重、副产杂酸，影响丙二酸
2、在一个方面，本专利技术提供一种重组大肠杆菌(escherichia coli)，能够以葡萄糖为原料，由草酰乙酸-天冬氨酸途径合成丙二酸，该重组大肠杆菌具有降低的丙酮酸激酶pyka和/或丙酮酸甲酸裂解酶pflb和/或乳酸脱氢酶ldha和/或磷酸转乙酰酶—乙酸激酶pta-acka的表达量和/或活性，并分模块组成型过量表达大肠杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、天冬氨酸转氨酶aspc和天冬氨酸-α-脱羧酶pand以及铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132、大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶ynei和谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)来源的丙酮酸羧化酶pyc。
3、在一些实施方案中，上述重组大肠杆菌中，所述降低的丙酮酸激酶pyka的表达量和/或活性是通过敲除丙酮酸激酶的编码基因pyka来实现的；
4、所述降低的丙酮酸甲酸裂解酶pflb的表达量和/或活性是通过敲除丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflb来实现的；
5、所述降低的乳酸脱氢酶ldha的表达量和/或活性是通过敲除乳酸脱氢酶的编码基因ldha来实现的；和/或
6、所述降低的磷酸转乙酰酶—乙酸激酶pta-acka的表达量和/或活性是通过敲除磷酸转乙酰酶—乙酸激酶的编码基因pta-acka来实现的。
7、在一些实施方案中，上述重组大肠杆菌中，通过使用cripsr-cas9技术敲除所述pyka基因和/或pflb基因和/或ldha基因和/或pta-acka基因；
8、通过敲除pyka基因，减少流入tca循环的碳通量，实现通过抑制竞争途径的方式提高大肠杆菌合成丙二酸的产量；
9、通过敲除pflb基因、ldha基因、pta-acka基因，减少分支产生的甲酸、乳酸、乙酸，减少nadh(丙酮酸生成乳酸过程消耗nadh)及碳流的消耗，提高大肠杆菌合成丙二酸的产量。
10、在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，运用crispr/cas9技术敲除大肠杆菌e.coli bl21(de3)基因组中的pyka基因和/或pflb基因和/或ldha基因和/或pta-acka基因，得到以下菌株：
11、4株单独敲除ldha基因、pflb基因、pta-acka基因、pyka基因的大肠杆菌：bl21△ldha、bl21△pflb、bl21△pta-acka及bl21△pyka；
12、3株组合双敲除pyka基因和选自ldha基因、pta-acka基因、pflb基因中的一种的大肠杆菌：bl21△pyka△ldha、bl21△pyka△pta-acka及bl21△pyka△pflb；
13、1株敲除ldha基因、pflb基因和pta-acka基因的大肠杆菌：bl21△ldha△pflb△pta-acka；和
14、1株敲除pyka基因、ldha基因、pflb基因和pta-acka基因的大肠杆菌：bl21△pyka△ldha△pflb△pta-acka。
15、在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述分模块组成型过量表达所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、所述天冬氨酸转氨酶aspc、所述天冬氨酸-α脱羧酶pand、所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132、所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei和所述丙酮酸羧化酶pyc是指单独表达这些酶。
16、在一些优选的实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述分模块组成型过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、所述天冬氨酸转氨酶aspc、所述天冬氨酸-α-脱羧酶pand、所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132、所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei和所述丙酮酸羧化酶pyc是指将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和所述天冬氨酸转氨酶aspc融合表达，将所述天冬氨酸-α-脱羧酶pand和所述丙酮酸羧化酶pyc单独表达，将所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132融合表达。
17、在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述分模块组成型过量表达使用的启动子是组成型启动子ml2719，其序列如seq id no:39所示。
18、在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，以大肠杆菌bl21(de3)为宿主。
19、在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、所述天冬氨酸转氨酶aspc和所述天冬氨酸-α-脱羧酶pand来自大肠杆菌bl21(de3)。
20、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei来自大肠杆菌k12。
21、在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述磷酸烯醇式丙本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)，能够以葡萄糖为原料，由草酰乙酸-天冬氨酸途径合成丙二酸，其特征在于：该重组大肠杆菌具有降低的丙酮酸激酶pykA和/或丙酮酸甲酸裂解酶pflB和/或乳酸脱氢酶ldhA和/或磷酸转乙酰酶—乙酸激酶pta-ackA的表达量和/或活性，并分模块组成型过量表达大肠杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、天冬氨酸转氨酶aspC和天冬氨酸-α-脱羧酶panD以及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132、大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶yneI和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的丙酮酸羧化酶pyc。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述降低的丙酮酸激酶pykA的表达量和/或活性是通过敲除丙酮酸激酶的编码基因pykA来实现的；
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述分模块组成型过量表达是将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和所述天冬氨酸转氨酶aspC融合表达，将所述天冬氨酸-α-脱羧
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述分模块组成型过量表达使用的启动子是组成型启动子ML2719；
5.一种构建权利要求1-4任一项所述的重组大肠杆菌的方法，包括敲除大肠杆菌宿主中的pykA基因和/或pflB基因和/或ldhA基因和/或pta-ackA基因，从而得到基因缺陷的基因工程菌株，再将含有编码大肠杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD以及编码铜绿假单胞菌来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0132、编码大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶基因yneI和编码谷氨酸棒状杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因pyc的一个或多个质粒转入其中进行分模块组成型过量表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过使用CRIPSR-CAS9技术敲除所述pykA基因和/或pflB基因和/或ldhA基因和/或pta-ackA基因。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述分模块组成型过量表达包括将融合表达所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和所述天冬氨酸转氨酶基因aspC的质粒，单独表达所述天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD和所述丙酮酸羧化酶基因pyc的质粒以及融合表达所述琥珀酸半醛脱氢酶基因yneI和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0132的质粒转入所述基因缺陷的基因工程菌株中进行分模块组成型过量表达的步骤。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于：所述分模块组成型过量表达使用的启动子是组成型启动子ML2719；
9.一种发酵生产丙二酸的方法，包括将权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌接种于含4-8g/L葡萄糖的SOB培养基中，在溶解氧浓度为15％-35％的环境下，30-42℃、200-800r/min发酵至少12h。
10.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌或权利要求9所述的方法在制备丙二酸及其衍生产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌(escherichia coli)，能够以葡萄糖为原料，由草酰乙酸-天冬氨酸途径合成丙二酸，其特征在于：该重组大肠杆菌具有降低的丙酮酸激酶pyka和/或丙酮酸甲酸裂解酶pflb和/或乳酸脱氢酶ldha和/或磷酸转乙酰酶—乙酸激酶pta-acka的表达量和/或活性，并分模块组成型过量表达大肠杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、天冬氨酸转氨酶aspc和天冬氨酸-α-脱羧酶pand以及铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132、大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶ynei和谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)来源的丙酮酸羧化酶pyc。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述降低的丙酮酸激酶pyka的表达量和/或活性是通过敲除丙酮酸激酶的编码基因pyka来实现的；
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述分模块组成型过量表达是将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和所述天冬氨酸转氨酶aspc融合表达，将所述天冬氨酸-α-脱羧酶pand和所述丙酮酸羧化酶pyc单独表达，将所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132融合表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述分模块组成型过量表达使用的启动子是组成型启动子ml2719；
5.一种构建权利要求1-4任一项所述的重组大肠杆菌的方法，包括敲除大肠杆菌宿主中的pyka基因和/或pflb基因和/或ldha基因和/或pta-ack...
【专利技术属性】
技术研发人员：张雅萍，刘岩，王竞辉，王琛，吴计划，王婕，
申请(专利权)人：万华化学四川有限公司，
类型：发明
国别省市：
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