【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及软骨表层细胞来源的外泌体在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
技术介绍
1、骨性关节炎(osteoarthritis,oa)是牵涉不同组织和不同病理过程、发病机制未明的常见疾病，可采用外敷膏药、口服消炎止痛药物、针灸、关节腔注射药物等非手术治疗，以及采用截骨、部分关节置换或全关节置换术治疗。非手术治疗主要适用于早期轻度骨性关节炎患者，但效果有限。中重度骨性关节炎患者多采用关节置换术治疗，但关节置换技术水平要求高，老年人手术风险大，假体使用寿命有限，治疗费用高。因此，急需开发新的有效的治疗手段。
2、软骨表层细胞(superficial layer cell,sfc)细胞小，单个分布，研究表明：部分sfc具备典型的干细胞特征：自我更新及多项分化潜能，且能分化成为深层软骨细胞，维持软骨稳态。此外，由于sfc处于关节表面，直接面对力学刺激，因此sfc较深层软骨细胞承受更大的力学载荷(约2倍)，而这种特殊力学微环境对sfc正常代谢起着重要作用，如分泌胶原、透明质酸及关节滑液蛋白lubricin(也被称为软骨表层蛋白)等。
3、然而，细胞治疗存在一些风险，活细胞进入体内会致癌免疫反应等，所以潜在的sfc临床转化的选择应慎重考虑。
4、现有研究报道外泌体可用于治疗oa，包括富血小板血浆来源的外泌体、间充质干细胞来源外泌体、骨髓间充质干细胞来源外泌体、脂肪间充质干细胞来源外泌体、诱导多能干细胞来源外泌体、肾细胞来源外泌体。外泌体的直径足够小(30-150nm)，不仅可以快速
5、本专利技术首次提取了sfc产生的外泌体，应用于小鼠oa的治疗中，取得了良好的治疗效果。与传统的细胞治疗相比，外泌体具有稳定性好、保存及应用方便快捷的特点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供软骨表层细胞来源的外泌体在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、本专利技术发现软骨表层细胞来源的外泌体对小鼠骨性关节炎有很好的治疗效果，因此，软骨表层细胞来源的外泌体具有制备治疗骨性关节炎的药物或制剂的应用。所述外泌体可降低活细胞进入体内引起的致癌免疫反应。
4、所述的软骨表层细胞通过包括下述步骤的方法得到：取新生小鼠，收取其胫骨与股骨的骺端软骨，清除表面软组织，先后用胰蛋白酶、i型胶原酶进行消化，收取消化液，离心得到软骨表层细胞原代细胞。将软骨表层细胞原代细胞于含胎牛血清的培养基中培养，再用ii型胶原酶消化，消化所得细胞在含胎牛血清、谷氨酰胺的培养基中培养、扩增，得到软骨表层细胞。以后每两到三天换液或消化后传代培养。其中，用胰蛋白酶、i型胶原酶进行消化的条件优选为：0.2-0.3％胰蛋白酶37℃消化0.5-1.5小时、0.5-1mg/ml的i型胶原酶37℃消化0.5-1.5小时；用ii型胶原酶消化的条件优选为：0.5-1.5mg/ml的ii型胶原酶37℃消化1.5-2.5小时；所述的培养基优选为dmem培养基，胎牛血清的含量优选为5-15％，谷氨酰胺的含量优选为0.5-1.5％。
5、进一步地，所述的软骨表层细胞通过包括下述步骤的方法得到：取出生后1-3天的新生小鼠，收取其胫骨与股骨的骺端软骨，清除表面软组织，0.25％胰蛋白酶37℃消化1小时，0.75mg/ml的i型胶原酶37℃消化1小时后，收取消化液，离心得到软骨表层细胞原代细胞，于含10％胎牛血清的dmem培养基中培养。长至70％-80％后备用，1mg/ml的ii型胶原酶37℃消化2小时，将消化所得细胞种植于培养瓶中，以dmem+10％胎牛血清+1％谷氨酰胺培养、扩增，得到软骨表层细胞。以后每两到三天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。
6、所述的软骨表层细胞来源的外泌体通过包括下述步骤的方法得到：将软骨表层细胞离心收集上清后使用外泌体提取纯化试剂盒制备得到外泌体。
7、进一步地，所述的软骨表层细胞来源的外泌体通过包括下述步骤的方法得到：
8、(1)细胞预处理：取传代培养的软骨表层细胞离心收集上清液。该步骤中离心的条件优选为4℃、3000g离心10min。
9、(2)外泌体的制备：将上清液与exosomoe concentration solution(ecs试剂)混匀，充分静置后再离心，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；用1×pbs重悬沉淀物，重悬液再次离心保留上清液，该上清液富含外泌体颗粒。该步骤中，第一次离心的条件优选为4℃、10000g离心60min；第二次离心的条件优选为4℃、12000g离心2min。
10、(3)外泌体的纯化：将含外泌体颗粒的上清液转入exosomoe purificationfilter(epf柱)上室中，离心后收集epf柱管底的液体，得到纯化后的外泌体颗粒。该步骤中，离心的条件优选为4℃、3000g离心10min。
11、更进一步地，所述的软骨表层细胞来源的外泌体通过包括下述步骤的方法得到：
12、(1)细胞预处理：将软骨表层细胞转移至离心管中，于4℃以3000g离心10min，去除样品中的细胞碎片，去除细胞碎片的离心上清液转移到新的离心管中。
13、(2)外泌体的制备：在装有离心上清液的离心管中加入exosomoe concentrationsolution(ecs试剂)；加入ecs试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1min，再放置于4℃静置2h；取出装有混合液的离心管于4℃以10000g离心60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；取1×pbs均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的离心管中；将含有重悬液的离心管于4℃以12000g离心2min，保留上清液，该上清液富含外泌体颗粒。
14、(3)外泌体的纯化：将收获的含外泌体颗粒的上清液转入exosomoe purificationfilter(epf柱)上室中，于4℃以3000g离心10min，离心后收集epf柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒。
15、所述的治疗骨性关节炎的药物或制剂的剂型为针剂，通过将外泌体溶解在注射用生理盐水中制成，其给药方式为关节腔注射。
16、本专利技术相对于现有技术具有的优点和有益效果：
17、1.软骨表层细胞来源的外泌体在骨性关节炎的临床治疗领域具有非常可观的应用前景，其能延缓骨性关节炎的进程，降低关节炎症反应，缓解组织器官损伤。
18、2.与传统的细胞治疗相比，本专利技术提供的外泌体可在-80度长期保存(至少1年)，溶解后即可使用，避免了sfc冻存和复苏的不便，以及可能造成细胞活力和功能改变的风险。
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1.软骨表层细胞来源的外泌体在制备治疗骨性关节炎的药物或制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞通过包括下述步骤的方法得到：取新生小鼠，收取其胫骨与股骨的骺端软骨，清除表面软组织，先后用胰蛋白酶、I型胶原酶进行消化，收取消化液，离心得到软骨表层细胞原代细胞；将软骨表层细胞原代细胞于含胎牛血清的培养基中培养，再用II型胶原酶消化，消化所得细胞在含胎牛血清、谷氨酰胺的培养基中培养、扩增，得到软骨表层细胞；以后每两到三天换液或消化后传代培养。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞通过包括下述步骤的方法得到：取出生后1-3天的新生小鼠，收取其胫骨与股骨的骺端软骨，清除表面软组织，0.25％胰蛋白酶37℃消化1小时、0.75mg/mL的I型胶原酶37℃消化1小时，收取消化液，离心得到软骨表层细胞原代细胞；软骨表层细胞原代细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，长至70％-80％后，1mg/mL的II型胶原酶37℃消化2小时，消化所得细胞在含10％
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞来源的外泌体通过包括下述步骤的方法得到：将软骨表层细胞离心收集上清后使用外泌体提取纯化试剂盒制备得到外泌体。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞来源的外泌体通过包括下述步骤的方法得到：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞来源的外泌体通过包括下述步骤的方法得到：
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的外泌体溶解在注射用生理盐水中制成针剂使用。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的外泌体的给药方式为关节腔注射。
...【技术特征摘要】
1.软骨表层细胞来源的外泌体在制备治疗骨性关节炎的药物或制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞通过包括下述步骤的方法得到：取新生小鼠，收取其胫骨与股骨的骺端软骨，清除表面软组织，先后用胰蛋白酶、i型胶原酶进行消化，收取消化液，离心得到软骨表层细胞原代细胞；将软骨表层细胞原代细胞于含胎牛血清的培养基中培养，再用ii型胶原酶消化，消化所得细胞在含胎牛血清、谷氨酰胺的培养基中培养、扩增，得到软骨表层细胞；以后每两到三天换液或消化后传代培养。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的软骨表层细胞通过包括下述步骤的方法得到：取出生后1-3天的新生小鼠，收取其胫骨与股骨的骺端软骨，清除表面软组织，0.25％胰蛋白酶37℃消化1小时、0.75mg/ml的i型胶原酶37℃消化1小时，收取消化液，离心得到软骨表层细胞原代细胞；软骨表层细胞原代细胞于含10％胎牛血清的...
【专利技术属性】
技术研发人员：童伟，田洪涛，裴鸿鑫，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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