【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种慢病毒大规模纯化方法及其应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、在生物医学领域，慢病毒作为一类常见的递送工具，在基因治疗和基因转导等应用中扮演着重要角色。然而，目前在慢病毒的生产和纯化过程中仍然存在一些挑战，如低产量、纯度不高、工艺繁琐等问题。慢病毒在纯化过程中存在一定的异质性，而不同的慢病毒株和表达系统可能需要不同的纯化条件。此外，慢病毒颗粒的特性可能会受到细胞培养条件、产生慢病毒的细胞类型以及病毒载体的影响，这也增加了纯化过程的复杂性。因此，开发一种高效、简便、低成本的慢病毒纯化方法成为了该领域的研究重点。
3、传统的慢病毒纯化方法主要采用超速离心法，但这种方法存在多次离心导致纯化周期长、不适合大规模工艺放大、容易受到外界条件变化的影响，同时也容易造成产品的损失。因此，研究人员开始寻求新的纯化技术来解决这些问题。
4、随着蛋白质工程和纯化技术的不断进步，两步层析纯化技术成为一种备受关注的方法。两步层析纯化技术结合了尺寸排阻层析和离子层析的优势，能够在较短的时间内高效地获得目标产品，并保持较高的产量和纯度。在慢病毒纯化过程中，通过在细胞培养上清液中选择性地捕获慢病毒，并经过一系列纯化步骤得到慢病毒制剂，这一方法具有巨大的潜力。然而，由于慢病毒颗粒本身的不稳定性，且对于温度、离子强度、ph和剪切力等条件极度敏感，现有的慢病
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术公开了一种慢病毒大规模纯化方法及其应用。本专利技术通过利用优化的含保护剂的慢病毒纯化缓冲体系，结合切向流超滤装置（tff）及层析工艺进行慢病毒纯化，层析过程采用capto core 700和capto q impres两种类型层析填料相结合，既保证了慢病毒在纯化过程中保持最大活性，提高了回收率和滴度，同时方便纯化工艺的放大，解决了慢病毒规模化生产制备问题。
2、本专利技术的慢病毒大规模纯化方法可以达到gmp级别。gmp是英文goodmanufacturing practice 的缩写，中文含义是“良好生产规范”。世界卫生组织将gmp定义为指导食物、药品、医疗产品生产和质量管理的法规。
3、具体地，本专利技术的技术方案如下所述：
4、本专利技术的第一方面，提供一种慢病毒大规模纯化方法，包括以下步骤：
5、（1）慢病毒包装：使用293t细胞进行慢病毒包装。
6、（2）慢病毒澄清：收集经步骤（1）包装的慢病毒上清液，对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液。
7、（3）切向流超滤装置tff浓缩换液：对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置tff浓缩换液获得超滤浓缩液。
8、（4）层析纯化：先采用复合模式层析填料capto core 700对所述超滤浓缩液进行纯化，得到慢病毒料液，再对所述慢病毒料液进行离子交换填料capto q impres层析纯化，得到慢病毒溶液。
9、（5）超滤换液：对步骤（4）得到的所述慢病毒溶液进行超滤换液处理。
10、（6）过滤除菌：经超滤换液后的慢病毒溶液使用孔径0.22 μm的滤器过滤除菌，得到纯化后的慢病毒。
11、在一种具体的实施方式中，步骤（1）中，所述使用293t细胞进行慢病毒包装，包括：
12、1）复苏293t细胞，依次使用t25、t75、t125和t225细胞培养瓶进行细胞传代培养，培养温度设置为37℃，co2浓度为5~6%。
13、2）慢病毒包装系统为四质粒系统，质粒用量为34~36 μg/cm2，转染试剂使用pei，pei与质粒用量比例为2~4：1。
14、3）转染时先将质粒和pei放置室温孵育4~6 min，然后将pei加入到质粒培养基混合物中混匀，室温孵育30~60 min后加入至293t细胞培养瓶中继续培养。
15、4）慢病毒收获前1.5~2.5 h，按照25~30 u/ml加入核酸酶进行消化处理。
16、在一种具体的实施方式中，步骤（2）中，所述对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液，包括：使用0.45 μm滤器过滤所述慢病毒上清液，去除细胞、细胞碎片及其他杂质，得到慢病毒澄清液。
17、在一种具体的实施方式中，步骤（3）中，对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置tff浓缩换液获得超滤浓缩液的具体步骤包括：使用100~750 kd膜包切向流超滤装置tff浓缩换液，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar，将所述慢病毒澄清液浓缩10~20倍。
18、优选地，使用300kd膜包切向流超滤装置tff浓缩换液。优选地，换液采用的缓冲体系buffer为ph 8.0 50 mm tris、130 mm nacl、10%蔗糖。
19、在一种具体的实施方式中，步骤（4）中，使用的复合模式层析填料为capto core700，纯化缓冲体系采用ph 8.0 50 mm tris、130 mm nacl、10%蔗糖缓冲体系，上样体积小于0.3 cv，流速设置为200 cm/h。
20、在一种具体的实施方式中，步骤（4）中，使用离子交换填料为capto q impres，buffer a为ph 8.0 50 mm tris、130 mm nacl、10%蔗糖，buffer b为ph 8.0 50 mm tris、1m nacl、10%蔗糖，使用buffer b进行等度洗脱。
21、在一种具体的实施方式中，步骤（5）中，超滤换液使用100~750 kd膜包，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar，优选地，超滤换液使用300kd膜包。
22、在一种具体的实施方式中，步骤（6）中，使用孔径0.22 μm的无菌滤器进行过滤除菌。
23、在一种具体的实施方式中，步骤（6）之后还包括：将所述纯化后的慢病毒按照1ml/管进行分装，-80℃进行保存。
24、在本专利技术的第二方面，提供一种第一方面所述慢病毒大规模纯化方法在病毒纯化领域中的应用。
25、本专利技术具有以下有益效果：
26、本专利技术中的慢病毒大规模纯化方法通过优化含保护剂的慢病毒纯化缓冲体系，结合切向流超滤装置（tff）及层析工艺进行慢病毒纯化，层析过程采用capto core 700和capto q impres两种类型层析填料相结合，保证了慢病毒在纯化过程中保持最大活性，提高了回收效率和滴度，同时方便纯化工艺的放大，解决了慢病毒规模化生产制备问题。
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1.一种慢病毒大规模纯化方法在病毒纯化领域中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液，包括：使用0.45 μm滤器过滤所述慢病毒上清液，去除细胞、细胞碎片及其他杂质，得到慢病毒澄清液。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置浓缩换液获得超滤浓缩液的过程中，使用100~750 KD膜包切向流超滤装置浓缩。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，使用的复合模式层析填料为Capto Core 700，上样体积小于0.3 CV，流速设置为200 cm/h。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，使用离子交换填料为Capto QImpres，缓冲体系A为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖，缓冲体系B为pH 8.0 50mM Tris、1M NaCl、10%蔗糖，使用缓冲液B进行等度洗脱。
【技术特征摘要】
1.一种慢病毒大规模纯化方法在病毒纯化领域中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液，包括：使用0.45 μm滤器过滤所述慢病毒上清液，去除细胞、细胞碎片及其他杂质，得到慢病毒澄清液。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置浓缩换液获得超滤浓缩液的过程中，使用100~750 kd膜包切向流...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱学良，苏彦鑫，庞庆霄，张兰增，闫军燕，梁衡，
申请(专利权)人：山东丽山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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