【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物次生代谢，尤其涉及一种玉米p450基因修饰玉米萜烯合成基因zmdls产生薄荷醇的方法及应用。
技术介绍
1、萜类化合物是指存在自然界中、分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧衍生物，这些含氧衍生物可以是醇、醛、酮、羧酸、酯等。萜类化合物广泛存在于自然界，是构成某些植物的香精、树脂、色素等的主要成分。萜类化合物有许多的生理活性，如祛痰、止咳、驱风、发汗、驱虫、镇痛。
2、萜类化合物是植物次生代谢产生的一类天然产物，来源于前体物质异戊烯基焦磷酸(ipp)和其异构体二甲烯丙基焦磷酸(dmapp)。ipp和dmapp的合成途径有两种：甲羟戊酸(mva)途径和2-c-甲基-d-赤藓糖醇-4-磷酸(mep)途径。不同生物合成萜类途径及产物的亚细胞定位有关，其中，mva途径定位于胞质，而mep途径定位于质体。萜类合成酶是萜类化合物生物合成的关键酶。萜类合成酶肽链的长度通常有550～850个氨基酸残基，倍半萜合酶肽链的长度为550～580个氨基酸。按照萜类合成酶的结构与反应机制的不同，可分为classi类和class ii类两类；其中，i类酶的催化活性位点有α结构域，有两个高度保守的基序ddxxd和nse/dte；ii类酶的活性位点有β结构域，含有1个保守基序dxdd。
3、植物细胞色素p450(cyp450s)是超基因家族编码的单加氧酶，也是首次被归类为“超级家族”的酶类，该酶类蛋白通常与内质网、质体、线粒体、高尔基体等细胞器膜系统结合在一起，参与生命活动过程中的诸多代谢过程。因cyp450s与还原
4、然而，目前还未有见研究cyp450s修饰萜烯zmdls合成基因方面的研究。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种玉米p450基因修饰玉米萜烯合成基因zmdls产生薄荷醇的方法及应用。
2、其中，玉米萜烯合成基因zmdls是一种编码d-柠檬烯合酶的基因，d-柠檬烯合酶是萜类化合物d-柠檬烯形成的关键酶。
3、薄荷醇，也称为薄荷樟脑，是一种环状单萜醇(萜类化合物的一种)。有研究表明，薄荷醇可促进药物透过皮肤。由于皮肤角质层屏障的存在及药物自身的理化性质等原因，许多药物对皮肤的透过率很低，难以达到有效的治疗浓度，因而薄荷醇可被添加于皮肤等外用制剂中，发挥局部止痒、止痛、清凉及轻微局麻等作用。
4、本专利技术通过筛选合适的玉米p450基因来修饰玉米萜烯合成基因zmdls，可将zmdls产生的d-柠檬烯转化成薄荷醇，进而实现薄荷醇的合成生产。
5、本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
6、一种玉米p450基因修饰玉米萜烯合成基因zmdls产生薄荷醇的方法，通过基因工程方法构建玉米p450基因zmcyp709e4与玉米萜烯合成基因zmdls共表达的重组菌株，利用所得重组菌株生产薄荷醇；其中，所述玉米萜烯合成基因zmdls的核苷酸序列如seq idno.1所示，玉米p450基因zmcyp709e4的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、作为本专利技术的优选方式之一，所述通过基因工程方法构建玉米p450基因zmcyp709e4与玉米萜烯合成基因zmdls共表达的重组菌株的步骤中，先分别构建pmal-c2x-zmdls、pmal-c2x-zmcyp709e4重组质粒，再将所述pmal-c2x-zmdls、pmal-c2x-zmcyp709e4重组质粒同时转化到大肠杆菌bl21中。
8、作为本专利技术的优选方式之一，所述玉米萜烯合成基因zmdls编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示。
9、作为本专利技术的优选方式之一，所述玉米p450基因zmcyp709e4编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.4所示。
10、作为本专利技术的优选方式之一，通过玉米p450基因zmcyp709e4修饰玉米萜烯合成基因zmdls，将zmdls产生的d-柠檬烯转化成薄荷醇。
11、一种上述玉米p450基因修饰玉米萜烯合成基因zmdls产生薄荷醇的方法的应用，在菌株中共表达玉米p450基因zmcyp709e4与玉米萜烯合成基因zmdls，获得薄荷醇高产株，用于薄荷醇生产。
12、本专利技术相比现有技术的优点在于：
13、本专利技术利用基因组及转录组数据，筛选克隆玉米萜烯合成基因zmdls和玉米p450基因zmcyp709e4，通过实验验证了zmcyp709e4修饰zmdls产生单萜醇类-薄荷醇。本专利技术首先通过构建萜烯合成基因zmdls突变株系和过表达本体株系，玉米螟幼虫咬食玉米zmdls、b73和zmdls-oe，之后通过荧光定量观察zmdls和zmcyp709e4表达量的变化。可见zmdls和zmcyp709e4之间的变化相似，两者之间可能存在一定的关系，我们对zmdls进行体外酶活分析作为对照，之后将zmcyp709e4和zmdls共表达进行体外酶活分析，观察在zmcyp709e4的修饰下，可以将zmdls产生的d-柠檬烯转化薄荷醇。
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1.一种玉米P450基因修饰玉米萜烯合成基因ZmDLS产生薄荷醇的方法，其特征在于，通过基因工程方法构建玉米P450基因ZmCYP709E4与玉米萜烯合成基因ZmDLS共表达的重组菌株，利用所得重组菌株生产薄荷醇；其中，所述玉米萜烯合成基因ZmDLS的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，玉米P450基因ZmCYP709E4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的玉米P450基因修饰玉米萜烯合成基因ZmDLS产生薄荷醇的方法，其特征在于，所述通过基因工程方法构建玉米P450基因ZmCYP709E4与玉米萜烯合成基因ZmDLS共表达的重组菌株的步骤中，先分别构建pMAL-c2x-ZmDLS、pMAL-c2x-ZmCYP709E4重组质粒，再将所述pMAL-c2x-ZmDLS、pMAL-c2x-ZmCYP709E4重组质粒同时转化到大肠杆菌BL21中。
3.根据权利要求1所述的玉米P450基因修饰玉米萜烯合成基因ZmDLS产生薄荷醇的方法，其特征在于，所述玉米萜烯合成基因ZmDLS编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。<...
【技术特征摘要】
1.一种玉米p450基因修饰玉米萜烯合成基因zmdls产生薄荷醇的方法，其特征在于，通过基因工程方法构建玉米p450基因zmcyp709e4与玉米萜烯合成基因zmdls共表达的重组菌株，利用所得重组菌株生产薄荷醇；其中，所述玉米萜烯合成基因zmdls的核苷酸序列如seqid no.1所示，玉米p450基因zmcyp709e4的核苷酸序列如seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述的玉米p450基因修饰玉米萜烯合成基因zmdls产生薄荷醇的方法，其特征在于，所述通过基因工程方法构建玉米p450基因zmcyp709e4与玉米萜烯合成基因zmdls共表达的重组菌株的步骤中，先分别构建pmal-c2x-zmdls、pmal-c2x-zmcyp709e4重组质粒，再将所述pmal-c2x-zmdls、pmal-c2x-zmcyp709e4重组质粒同时转化到大肠杆菌bl21中。
3.根据权利要求1所述的玉...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊洪泓，程鑫辉，李廷春，孙旭，刘林，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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