【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其是涉及一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法。
技术介绍
1、试验研究使用的原代角质形成细胞通常是从志愿者的皮肤组织中提取的。但是，皮肤组织的来源有限，提取过程繁琐，导致角质形成细胞的产量存在局限性，无法满足实验研究的需求。
2、另一方面，目前大量的研究需要模拟人表皮环境而常用的hacat皮肤角质形成细胞系与人原代角质形成细胞存在一定的差异。再者，目前角质形成细胞移植也能够用于白癜风等色素缺失性疾病的治疗，而角质形成细胞数量长期限制了该疗法的使用。因而，通过多能干细胞分化角质形成细胞成为了实验室获取大量角质形成细胞的最佳选择。
3、人胚胎干细胞(hesc)来源于囊胚期的人胚胎内细胞团，具有无限增殖和分化为组成三胚层所有类型体细胞的独特能力，亦能分化为皮肤角质形成细胞。然而，目前诱导hesc分化为角质形成细胞的方法一般需要使用含有动物源成分的材料，如小鼠来源的滋养层细胞和(或)细胞外基质(extracellular matrix,ecm)。动物源成分可能增加了hesc培养中感染动物病原和病毒或细菌的风险。此外，有研究发现，hesc暴露于动物成分可能引起hesc中免疫相关因子(如羟乙酰神经氨酸和乙酰神经氨酸)的高表达，从而增强hesc源性细胞的免疫原性。hesc向角质形成细胞的诱导分化过程中，使用动物源成分必然影响将来干细胞分化得到的角质形成细胞的临床应用。
技术实现思路
1、为优化诱导效率，同时减少多能干细胞向角质形成细胞分化过
2、本专利技术提供的无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，在优化诱导效率的同时，减少了动物源材料的使用，因此临床应用生物安全性得到提高。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本专利技术提供一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，包括以下步骤：
5、1)配制分化细胞所需要的基质培养液diffkc medium；
6、2)培养多能干细胞：
7、利用gibco essential 8tm medium制备多能干细胞的悬液，并将多能干细胞滴入用basement membrane matrix,ldev-free包被的细胞培养板中培养；
8、3)多能干细胞分化角质形成细胞前体细胞：
9、在培养的第0-8天加入diffkc medium，每2天换液一次；
10、4)继续分化角质形成细胞：
11、在培养第8天，用0.01-1％的i型胶原溶液包被培养皿，将分化至第8天的细胞用gibcotm ctstm trypletm select enzyme消化，使用dk-sfm将得到的细胞重新制备为细胞悬液，并将细胞种植到包被好的培养皿上，用dk-sfm培养细胞，隔天换液一次，直至细胞出现肉眼可见的角质形成细胞群。
12、在本专利技术的一个实施方式中，所述diffkc medium为分化细胞所需要的基质培养液，为无血清的培养液，diffkc medium的组成为：以gibco dk-sfm培养基为基础，加入1-50g/l的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(its-x)，0.1-50ng/ml的骨形成蛋白-4，0.1-50um维a酸，0.01-5um的地塞米松，1-10ug/ml的人胰岛素样生长因子-1，0.1-50ng/ml骨形成蛋白-7。
13、在本专利技术的一个实施方式中，步骤2)中，培养多能干细胞的方法包括以下步骤：
14、21)培养多能干细胞：将多能干细胞从液氮罐中取出，水浴快速解冻，随后加入gibco essential 8tm medium，并于室温离心；
15、22)离心结束后，将上清液吸出，并加入gibco essential 8tm medium制备细胞悬液，并将细胞滴入用basement membrane matrix,ldev-free包被的细胞培养板中；
16、23)每天换液一次，直到细胞长满培养皿的60-80％。
17、在本专利技术的一个实施方式中，所述多能干细胞包括人类胚胎干细胞与人诱导多能干细胞。
18、在本专利技术的一个实施方式中，步骤4)继续分化角质形成细胞的方法具体包括以下步骤：
19、41)准备传代用培养皿：在第8天，用0.01-1％的i型胶原溶液包被培养皿，并放置到37℃培养箱1小时，随后，用1x dpbs溶液冲洗备用；
20、42)制备细胞悬液：将分化至第8天的细胞用gibcotm ctstm trypletm selectenzyme消化，在显微镜下观察到贴壁细胞脱离后加入1x dpbs溶液终止反应后，室温下离心，去掉上清液；
21、43)细胞传代：使用dk-sfm将离心得到的细胞重新制备为细胞悬液，并将细胞种植到步骤41)包被好的培养皿上；
22、44)使用dk-sfm培养细胞，隔天换液一次，直至细胞出现肉眼可见的角质形成细胞群。
23、在本专利技术的一个实施方式中，分化得到的角质形成细胞具有与人类正常原代角质形成细胞相似的细胞特性。
24、在本专利技术的一个实施方式中，分化得到的角质形成细胞使用dk-sfm继续培养，或更换为其他角质形成细胞培养液继续培养。
25、在本专利技术的一个实施方式中，分化得到的角质形成细胞使用角质形成细胞冻存液保存，或使用含dmso的血清冻存。
26、在本专利技术的一个实施方式中，分化得到角质形成细胞后，利用得到的角质形成细胞构建含色素细胞表皮片。
27、与现有技术相比，本专利技术根据现有无血清培养分化方法，提供了一种快速、高效率、无血清的角质形成细胞的分化方法。相比于目前存在的其他方法，本专利技术提供的方法耗时短、分化效率高，同时本方法不需要使用血清或其他动物来源的制剂，为将来在临床的应用提供了基础。
28、通过细胞免疫荧光检测、细胞流式检测方法证实，本专利技术方法通过将人类胚胎干细胞分化为的黑素细胞，分化出的角质形成细胞具有与人类正常原代角质形成细胞相似的细胞特性，并且在多次传代后细胞特性无显著的改变。
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1.一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，所述DiffKc Medium为无血清的培养液，DiffKc Medium的组成为：以Gibco DK-SFM培养基为基础，加入1-50g/L的ITS-X，0.1-50ng/mL的骨形成蛋白-4，0.1-50uM维A酸，0.01-5uM的地塞米松，1-10ug/mL的人胰岛素样生长因子-1，0.1-50ng/ml骨形成蛋白-7。
3.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，步骤2)中，培养多能干细胞的方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，所述多能干细胞包括人类胚胎干细胞与人诱导多能干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，步骤4)继续分化角质形成细胞的方法具体包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种无
7.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，分化得到的角质形成细胞使用DK-SFM继续培养，或更换为其他角质形成细胞培养液继续培养。
8.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，分化得到的角质形成细胞使用角质形成细胞冻存液保存，或使用含DMSO的血清冻存。
9.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，分化得到角质形成细胞后，利用得到的角质形成细胞构建含色素细胞表皮片。
10.基于权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的角质形成细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，所述diffkc medium为无血清的培养液，diffkc medium的组成为：以gibco dk-sfm培养基为基础，加入1-50g/l的its-x，0.1-50ng/ml的骨形成蛋白-4，0.1-50um维a酸，0.01-5um的地塞米松，1-10ug/ml的人胰岛素样生长因子-1，0.1-50ng/ml骨形成蛋白-7。
3.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，步骤2)中，培养多能干细胞的方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向角质形成细胞分化的方法，其特征在于，所述多能干细胞包括人类胚胎干细胞与人诱导多能干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种无血清的多能干细胞向...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐金华，张琦，曾炫皓，吕昊桢，吴复跃，何振东，
申请(专利权)人：上海尚瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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