【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、帕金森病(pd)是继阿尔茨海默病之后第二常见的进行性神经退行性疾病，其特征是黑质致密部中脑多巴胺(mda)神经元变性。目前的治疗通常采用旨在通过施用左旋多巴(也称为l-多巴)(多巴胺的前体)来增加多巴胺的生物利用度的药理学方法。然而，长期左旋多巴治疗的副作用对其在pd后期的使用提出了挑战。首先通过移植人类胎儿中脑组织来探索在pd患者体内重建功能性多巴胺能神经元的能力(lindvall等人(2004)neurorx 1:383-393对此进行了综述)。结果各不相同，并且该方法引起了对胎儿组织的可用性和使用的伦理担忧，从而导致了在体内重建多巴胺能神经元的替代方法。
2、多能干细胞(psc)(包括胚胎干(es)细胞系和诱导多能干细胞(ipsc))的可用性，开启了在体外产生mda神经元的祖细胞的可能性。发育研究表明，中脑多巴胺能神经元起源于腹侧中脑底板(mfp)，可以通过标志物foxa2和lmx1a的共表达来鉴定。用于衍生中脑底板前体的早期分化方案涉及psc中音猬因子(shh)的激活和典型wnt信号转导，以及双重smad抑制和fgf8激活，以及需要11天以实现表达foxa2和lmx1a的前体(kriks等人(2011)nature480:547-551)或涉及shh、wnt和fgf8的激活，以及添加视黄酸(ra)，为期22天的方案(cooper等人(2010)mol.cell.neurosci.45:258-266)。据报道，类似的方案中，其中将人类ipsc衍生的胚状体暴露于双重smad抑制五天，然后进行sh
3、最近，报道了从人多能干细胞中获得mb多巴胺能祖细胞的其他方案。例如，nolbrant等人报告了一个16天的方案，该方案涉及前11天暴露于n-2补充剂，后5天暴露于b27补充剂，以及shh和wnt激活以及alk抑制(nolbrant定等人(2017)nature protocols12:1962-1979)。precious等人报告了一个方案，该方案涉及mek抑制两天以阻断fgf信号转导，然后单独shh激活三天，并从第5天开始shh和fgf8激活，从而在第7天产生foxa2+lmx1a+祖细胞(precious等人(2020)front.neurosci.14:312)。gartner等人报告无异种物质、无饲喂物的化学成分确定的方案，其中涉及(i)在第0-5天在补充有ldn193189和sb431542的培养基中孵育，在第5-10天单独在补充有ldn193189的培养基中孵育，(ii)第2-13天在补充有chir99021的培养基中孵育，(iii)第1-7天在补充有shh和嘌吗啡胺的培养基中孵育(gartner等人(2020)star protocols 1:100065)。
4、使用方案也已将人多巴胺能神经元祖细胞与人精原干细胞(hssc)区分开来，所述方案涉及在补充有ra、sb、vpa和毛喉素的嗅鞘细胞条件培养基(oeccm)中培养hssc四天，然后在补充有shh、fgf8a和tfgβ3的oeccm中培养(yang等人(2019)stem cellres.therap.10:195)。
5、还已经描述了用于扩增中脑神经祖细胞的方法(fedele等人(2017)sci.reports7:6036)，以及冷冻保存此类祖细胞的方法(drummond等人(2020)front.cell.dev.biol.8:578907)。
6、例如，用于将多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经元前体的方案在arenas等人(2015)development 142:1918-1936和wang等人(2020)cells 9:1489中进行了综述。
7、因此，虽然已经取得了一些进展，但仍然需要用于从人多能干细胞产生中脑神经祖细胞的有效且稳健的方法和组合物。
技术实现思路
1、本公开提供了使用化学成分确定的培养基从多能干细胞产生人定向中脑(mb)神经干细胞(nsc)和中脑神经祖细胞(npc)的方法，该培养基允许在最少六天的培养时间内产生otx2+foxa2+lmx1a+mb npc。培养基缺乏血清或其他外源添加的生长因子，并包含小分子试剂，所述小分子试剂激动或拮抗多能干细胞中的特定信号转导通路活性，从而促进沿中脑神经谱系的分化，导致细胞成熟和中脑神经祖细胞相关的生物标志物的表达。本公开的方法具有以下优点：在培养基中使用小分子试剂允许精确控制培养物组分并且与现有技术方案相比显著缩短分化时间。
2、因此，在一方面，本公开涉及产生人otx2+foxa2+lmx1a+中脑神经祖细胞(npc)的方法，其包括：
3、(a)在第0-3天，在缺乏外源添加的生长因子并包含wnt通路激动剂、shh通路激动剂、bmp通路拮抗剂、akt通路拮抗剂和mek通路拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞，以获得定向中脑神经干细胞(nsc)；和
4、(b)在第4-6天，在缺乏外源添加的生长因子并包含bmp通路激动剂、ra通路激动剂、lxr通路激动剂、akt通路拮抗剂、mtor通路拮抗剂和tgfβ通路拮抗剂的培养基中培养定向中脑nsc，以在培养的第6天获得人otx2+foxa2+lmx1a+中脑npc。
5、在另一方面，本公开涉及产生人otx2+lmx1a+定向中脑神经干细胞(nsc)的方法，其包括：
6、第0-3天，在缺乏外源添加的生长因子并包含wnt通路激动剂、shh通路激动剂、bmp通路拮抗剂、akt通路拮抗剂和mek通路拮抗剂的培养基中培养人多能干细胞，以在培养第3天获得otx2+lmx1a+定向中脑nsc。
7、本文进一步详细描述了用于本公开的方法中的合适的激动剂和拮抗剂及其浓度的非限制性实例。
8、在一个实施方案中，人多能干细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。在另一个实施方案中，人多能干细胞是胚胎干细胞。
9、在一个实施方案中，在培养期间将人多能干细胞附着至玻连蛋白包被的板上。
10、在另一方面，本公开涉及用于获得人定向中脑神经干细胞的培养基，其包含wnt通路激动剂、shh通路激动剂、bmp通路拮抗剂、akt通路拮抗剂和mek通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
11、在另一方面，本公开涉及用于获得人中脑神经祖细胞的培养基，其包含bmp通路激动剂、ra通路激动剂、lxr通路激动剂、akt通路拮抗剂、mtor通路拮抗剂和tgfβ通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。
12、在另一方面，本公开涉及人定向中脑神经干细胞的分离的细胞培养物，该培养物包含在培养基中培养的人otx2+lmx1a+定向中脑神经干细胞，该培养基包含wnt通路激动剂、shh通路激动剂、bmp通路拮抗剂、akt通路拮抗剂和mek通路拮抗剂，并且缺乏外源添加的生长因子。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生人OTX2+FOXA2+LMX1A+中脑神经祖细胞(NPC)的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是胚胎干细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞在培养期间附着至玻连蛋白包被的板上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述WNT通路激动剂选自：CHIR99021、CHIR98014、SB 216763、SB 415286、LY2090314、3F8、A 1070722、AR-A 014418、BIO、AZD1080、WNT3A及其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述WNT通路激动剂以0.5-2.0μM的浓度存在于所述培养基中。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述WNT通路激动剂是CHIR99021，所述CHIR99021在步骤(a)和(b)中以1.1μM的浓度存在于所述培养基中。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述SHH通路激动剂以200-800nM的浓度存在于所述培养基中。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述SHH通路激动剂是嘌吗啡胺，所述嘌吗啡胺以550nM的浓度存在于所述培养基中。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述BMP通路拮抗剂选自：LDN193189、DMH1、DMH2、多索吗啡、K02288、LDN214117、LDN212854、卵泡抑素、ML347、头蛋白及其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述BMP通路拮抗剂以100-500nM的浓度存在于所述培养基中。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述BMP通路拮抗剂是LDN193189，所述LDN193189以275nM的浓度存在于所述培养基中。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述AKT通路拮抗剂选自：MK2206、GSK690693、哌立福辛(KRX-0401)、帕他色替(GDC-0068)、卡帕塞替尼(AZD5363)、PF-04691502、AT 7867、曲西利滨(NSC154020)、ARQ751、Miransertib(ab235550)、Bomssertib、Cerisertib及其组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述AKT通路拮抗剂以25-300nM的浓度存在于所述培养基中。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述AKT通路拮抗剂是MK2206，所述MK2206在步骤(a)中以138nM的浓度存在于所述培养基中，在步骤(b)中以50nM的浓度存在于所述培养基中。
17.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述MEK通路拮抗剂选自：PD0325901、贝美替尼(MEK162)、考比替尼(XL518)、司美替尼、曲美替尼(GSK1120212)、CI-1040(PD-184352)、瑞法替尼、ARRY-142886(AZD-6244)、PD98059、U0126、BI-847325、RO 5126766及其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述MEK通路拮抗剂以25-300nM的浓度存在于所述培养基中。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述MEK通路拮抗剂是PD0325901，所述PD0325901以110nM的浓度存在于所述培养基中。
20.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述BMP通路激动剂选自：BMP、sb4、ventromorphins及其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述BMP通路激动剂以10-25ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述BMP通路激动剂是BMP7，所述BMP7以15ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RA通路激动剂选自：TTNPB、AM580、CD 1530、CD 2314、Ch 55、BMS 753、他扎罗汀、异维A酸、AC 261066、视黄酸(RA)、Sr11237、阿达帕林、EC23、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸、4-氧代视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)及其组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述RA通路激动剂以10-...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种产生人otx2+foxa2+lmx1a+中脑神经祖细胞(npc)的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是胚胎干细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞在培养期间附着至玻连蛋白包被的板上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述wnt通路激动剂选自：chir99021、chir98014、sb 216763、sb 415286、ly2090314、3f8、a 1070722、ar-a 014418、bio、azd1080、wnt3a及其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述wnt通路激动剂以0.5-2.0μm的浓度存在于所述培养基中。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述wnt通路激动剂是chir99021，所述chir99021在步骤(a)和(b)中以1.1μm的浓度存在于所述培养基中。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述shh通路激动剂选自：嘌吗啡胺、gsa10、sag及其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述shh通路激动剂以200-800nm的浓度存在于所述培养基中。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述shh通路激动剂是嘌吗啡胺，所述嘌吗啡胺以550nm的浓度存在于所述培养基中。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述bmp通路拮抗剂选自：ldn193189、dmh1、dmh2、多索吗啡、k02288、ldn214117、ldn212854、卵泡抑素、ml347、头蛋白及其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述bmp通路拮抗剂以100-500nm的浓度存在于所述培养基中。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述bmp通路拮抗剂是ldn193189，所述ldn193189以275nm的浓度存在于所述培养基中。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述akt通路拮抗剂选自：mk2206、gsk690693、哌立福辛(krx-0401)、帕他色替(gdc-0068)、卡帕塞替尼(azd5363)、pf-04691502、at 7867、曲西利滨(nsc154020)、arq751、miransertib(ab235550)、bomssertib、cerisertib及其组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述akt通路拮抗剂以25-300nm的浓度存在于所述培养基中。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述akt通路拮抗剂是mk2206，所述mk2206在步骤(a)中以138nm的浓度存在于所述培养基中，在步骤(b)中以50nm的浓度存在于所述培养基中。
17.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述mek通路拮抗剂选自：pd0325901、贝美替尼(mek162)、考比替尼(xl518)、司美替尼、曲美替尼(gsk1120212)、ci-1040(pd-184352)、瑞法替尼、arry-142886(azd-6244)、pd98059、u0126、bi-847325、ro 5126766及其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述mek通路拮抗剂以25-300nm的浓度存在于所述培养基中。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述mek通路拮抗剂是pd0325901，所述pd0325901以110nm的浓度存在于所述培养基中。
20.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述bmp通路激动剂选自：bmp、sb4、ventromorphins及其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述bmp通路激动剂以10-25ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述bmp通路激动剂是bmp7，所述bmp7以15ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述ra通路激动剂选自：t...
【专利技术属性】
技术研发人员：N·阿米尼，
申请(专利权)人：特雷尔赫德生物系统股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。