【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子细胞遗传，具体涉及一种基于信号增强的寡核苷酸fish方法及其应用
技术介绍
1、荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization，fish)一直是植物分子细胞遗传学研究中最重要的技术。基于单拷贝dna序列的寡核苷酸(oligos) fish（oligo-fish）被开发并广泛应用于植物核型分析、染色体变异及跨物种染色体进化研究。基于单链dna的oligo-fish探针合成方法复杂、耗时长及费用投入高。申请号为cn201910432072.6的专利文件公开了一种基于多重pcr合成oligo-fish探针的方法，直接通过荧光修饰引物扩增获得双链的oligos探针，更加简便和灵活。虽然这些高密度的oligo-fish可以提高我们解析染色体结构的能力，但区分同一细胞内来自父母本同源染色体拷贝、定位小片段或单等位基因在技术上仍具有挑战性。
2、单倍型特异性oligo-fish在大基因组作物玉米中被开发并用于差异化绘制10号同源染色体，但小基因组植物因进化差异偏小导致可开发的单倍型特异性oligos少之又少。fish信号质量取决于所包含的oligos数目及荧光团的数目，经过pcr产生的单链或双链dnaoligos探针，每条链只携带一个荧光团，因此极少数目的oligos探针无法被荧光显微镜有效捕获，目前基于现有技术在小基因组植物无法有效开展同源染色体区分及后续研究。
3、随着基因组测序及组装技术的发展，高质量的参考基因组在作物进化研究和育种改良中至关重要，即使在t2
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法及其应用，解决因oligos探针密度不足导致的fish信号质量差或无法被捕捉的难题，能够实现小基因组植物同源染色体区分、小片段或单基因及渐渗序列的定位。同时也可以降低常规oligo-fish的设计密度，节约文库合成成本。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的基本原理：重构每条oligos的结构，包含42bp基因组序列、两侧35bp增强序列（35bp_se）及亚文库特异序列（20bp_sp），最终oligos探针由42bp基因组序列和两侧携带荧光团的35bp_se序列构成；双链dna oligos探针变性杂交处理时，42bp基因组序列与靶序列形成稳定杂交，而35bp_se序列处于单链状态，保留近oligos两侧2bp序列用于空间释放，剩余33bp_se序列可招募互补的荧光修饰二级oligos（2°-oligos），从而增加单个oligos探针携带的荧光团数目，实现fish信号增强。具体方法如下：
3、（1）oligos文库设计及合成：根据实验需要使用生物信息流程开发单倍型oligos，在每个oligos序列两侧分别连接35bp_se序列及20bp_sp序列，送生物公司合成oligos文库。
4、（2）oligos亚文库富集及探针合成：以原始oligos文库为模板，使用亚文库特异的常规20bp_sp引物扩增并富集得到亚oligos文库；以亚文库为模板，使用5’端荧光团修饰的20bp_se引物进行pcr扩增及后续纯化，可获得双链dna oligos探针，该探针由42bp基因组序列及两侧35bp_se序列构成，其中33bp_se序列用于招募互补的2°-oligos。
5、（3）2°-oligos荧光团修饰：对33bp_se序列及其互补序列的5’和3’端分别进行荧光团修饰包括但不限于fam和tamra，使用时将多个2°-oligos进行预混，工作液浓度为20μm。
6、（4）fish实验：本专利技术所述一种信号增强的oligo-fish方法，在染色体准备、预处理、杂交条件及镜检等步骤与常规oligo-fish兼容，只需在配制杂交混合液时额外加入1.0μl预混的2°-oligos，然后进行90℃高温变性5分钟，立即置于冰中待用。
7、本专利技术还提供了四个在植物中通用且符合常规oligo-fish热力学特征的35bp特异序列，其特征如下：
8、seq id no.1：taggcatcactgaggtagcatagaacggaagagtg
9、seq id no.2：tcggctcgttagattggacattactgctttgcgtt
10、seq id no.3：atgcgaacggtctcaatcaacaatcaccatcactg
11、seq id no.4：cttgtattcgctcatctccatcttaccagcatcca
12、本专利技术还提供了不同物种筛选单倍型oligos的生信流程以及在区分同源染色体、定位小片段或单基因以及鉴定渐渗片段中的应用。
13、本专利技术的有益效果：
14、本专利技术提供的一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法与常规oligo-fish兼容，且操作简单。常规oligo-fish为了获得较好的信号质量，往往选择大片段以设计数以千或万计的oligos密度，严重制约其可视化分辨率。本专利技术通过增加单条oligo携带荧光团数，可利用极少数目oligos探针实现对小基因组植物同源染色体全涂染区分、小片段或单基因定位和可视化，比常规oligo-fish拥有更高的可视化分辨率和更强的信号质量，且可显著降低文库合成成本。
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1.一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针由42bp基因组序列及两侧35bp信号增强序列构成。
2.根据权利要求1所述的一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法，其特征在于，所述35bp信号增强序列用于招募互补的荧光团修饰的33bp二级寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所述为单倍型和双5’端荧光团修饰的dsDNA寡核苷酸探针。
4.根据权利要求1所述的35bp信号增强序列，其特征在于，为下列序列中的一种或多种以及由此序列产生的33bp二级寡核苷酸及其互补序列，具体为：
5.根据权利要求4所述的33bp二级寡核苷酸及其互补序列，其特征在于，所述荧光团修饰分别在二级寡核苷酸及其互补序列的5’端和3’端。
6.根据权利要求2和6所述的寡核苷酸探针和二级寡核苷酸，其特征在于，所述荧光团为TAMRA和FAM。
7.根据要求1所述的一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法，其特征在于，所述的杂交混合液需额外加入1.0μL预混的二级寡核苷酸，浓度为20μM。>
8.一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法，其特征在于，包括在小基因组植物中区分同源染色体、定位小片段或单基因、鉴定渐渗片段中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针由42bp基因组序列及两侧35bp信号增强序列构成。
2.根据权利要求1所述的一种基于信号增强的单倍型寡核苷酸涂染方法，其特征在于，所述35bp信号增强序列用于招募互补的荧光团修饰的33bp二级寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所述为单倍型和双5’端荧光团修饰的dsdna寡核苷酸探针。
4.根据权利要求1所述的35bp信号增强序列，其特征在于，为下列序列中的一种或多种以及由此序列产生的33bp二级寡核苷酸及其互补序列，具体为：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈劲枫，赵勤政，程春燕，娄群峰，王瑜晖，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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