【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，特别涉及一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法及其在免疫荧光检测中的应用。
技术介绍
1、生物制品由于产品的特殊性，需要根据细胞的特性、培养历史以及操作过程，对病毒安全性做出合理的评估和检测。历史上也曾发生多次由于病毒污染而引起的严重安全性事件，其中genetech公司曾报道两次，以cho细胞生产的生物产品，由于mmv污染造成的巨大经济损失事件。所以生物安全被监管机构高度重视，尤其是病毒的生物安全。
2、介于生物安全的重要性，国内外监管机构对生物制品的病毒安全性提出了相应的要求和规定，主要法规有《中国药典三部-生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》2020年版，fda《points to consider in manufacture and testing ofmonoclonalantibody products for human use》，9cfr《detection ofextraneousviruses by the fluorescent antibody technique》等。在细胞系构建、细胞建库过程或者生产过程中使用了动物源成分的，则需要开展针对性的病毒检测，如牛源性病毒和猪源性病毒检测等。其中对于猪源性病毒检测，美国要求参照9cfr，需要检测的病毒有ppv、tgev、pav、reo-3、phev、bvdv、pi3、rv。由于国家对病毒的严格管控，上述病毒中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalom
3、免疫荧光检测是生物制品中法规规定的体外检测方法之一。免疫荧光检测法通过细胞培养方式来使原始病毒增殖，以提高检测的灵敏度，同时该方法可以确定蛋白的表达情况及病毒位置是否在细胞内，而pcr法无法确定病毒位置及蛋白的表达。免疫荧光法主要原理是带有荧光标记的抗体与特异的抗原结合，清洗未结合的抗体之后仍然检测到荧光，说明样本有特异性的病毒存在。用免疫荧光法开发和检测病毒时，需要对应的阳性对照来保证方法的开发及确保实验的有效性，这是检测时不可缺少的阳性对照组。上述病毒对应的荧光抗体都能在官方推荐的vmrd公司购买到，但由于病毒具有危害性，国家对病毒的管控严格，其中猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitisvirus，phev)较难购买。没有phev阳性对照就无法进行方法开发，检测阶段也无法判断检测的有效性。
4、vmrd是监管机构推荐的内外源病毒检测抗体供应商，该公司提供的抗体是根据病毒生产的特异性抗体，不提供具体的抗体和抗原靶位信息。在无抗原表位信息的情况下，需要分析病毒的蛋白结构，挑选可能成为抗原表位的蛋白进行表达，同时需要蛋白结构折叠正确，不能产生包涵体，筛选难度较大。这不但需要筛选到正确序列，还要有适当的表达系统使目的基因折叠出正确的蛋白三维结构。我们的系统通过细胞内表达病毒的部分蛋白筛选抗原，能快速筛选得到含有抗原的阳性细胞，得到的阳性细胞可实现免疫荧光方法开发，同时能为检测提供阳性对照。
技术实现思路
1、针对目前有些病毒荧光免疫检测时无法购买到阳性病毒的情况，本专利技术提供一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，该方法采用细胞内瞬时转染表达phev病毒不同蛋白的策略，筛选获得了病毒荧光抗体对应抗原，实现了特异性抗原阳性细胞的快速制备。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：
4、s1、猪血凝性脑脊髓炎病毒s蛋白表达质粒的构建，并对其密码子进行真核表达优化，优化后的序列为seq id no：1；
5、s2、将含有s蛋白的pcdna3.4质粒转染293t细胞；
6、s3、对转染s蛋白质粒的细胞进行固定；
7、s4、对固定的细胞进行免疫荧光检测。
8、本专利技术通过市售phev病毒荧光抗体筛选对应抗原，并挑选与抗体配对效果较好的蛋白作为阳性对照细胞进行免疫荧光开发或/和检测。
9、vmrd公司的phev荧光抗体无抗原表位信息，需要分析病毒的蛋白结构，选取可能成为抗原表位的蛋白序列进行表达，同时需要蛋白在表达时折叠出正确的三维结构以被抗体特异性地识别，抗原蛋白表达及筛选难度较大。本专利技术首先筛选了可以用于转染表达及成为抗原表位可能性较高的s蛋白，并对s蛋白的核酸序列进行真核表达密码子优化，其次通过质粒瞬转系统，将携带多抗原表位的phev的s蛋白作为目的蛋白进行转染表达，成功构建出vmrd公司phev荧光抗体能识别的特异性抗原，实现了无法获得病毒情况下阳性对照细胞的制备。
10、作为优选，s1中s蛋白表达质粒构建的具体方法是：
11、①从ncbi上获取较保守的phev病毒的s蛋白核酸序列，按真核生物表达体系的密码子进行优化，得到优化后的s蛋白，该蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示；
12、②将优化后的s蛋白构建到pcdna3.4载体，构建成真核系统表达载体；
13、③将构建好的表达质粒转染大肠杆菌，挑取单克隆，验证后扩培，抽提质粒，获得的质粒经验证后用于后期细胞转染实验。
14、作为优选，s2中293t细胞转染的具体方法是：
15、①当293t细胞密度长到60％-70％时，吸去培养板中的上清液，更换2-4ml含有2％fbs的dmem培养基，37℃，5％co2培养箱中培养；
16、②转染体系500ul/孔，根据质粒浓度按照1μg/孔，吸取猪血凝性脑脊髓炎病毒s蛋白质粒加入到装有无血清dmem培养基的质粒管中，混匀；
17、③取出提前配制的15ug/ml的pei溶液，使用无血清dmem培养基进行5倍稀释，根据②中加入质粒总体积的3-4倍体积吸取pei溶液至“pei管”中，混匀；
18、④将稀释后的“pei管”中液体滴加至“质粒管”中，混匀后静置，孵育20min；
19、⑤将孵育好的转染体系按照500ul/孔，滴加至培养孔中，混匀，放入37℃，5％co2培养箱培养；
20、⑥转染后24h，取出培养箱中的培养板，向培养瓶中加入2ml含2％fbsdmem培养液；
21、⑦转染后72h，取出培养箱中的培养板吸除上清并用pbs进行清洗后进行固定处理。
22、作为优选，s3、对转染目的基因的细胞进行固定具体步骤是：
23、①取出培养板，移除细胞培养基，用pbs润洗一次后加入80％丙酮1ml固定10m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于S1中S蛋白表达质粒构建的具体方法是：
3.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于S2中293T细胞转染的具体方法是：
4.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于S3、对转染目的基因的细胞进行固定具体步骤是：
5.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原的制备方法，其特征在于S4、固定细胞的免疫荧光检测具体步骤是：
6.一种权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法在免疫荧光检测中的应用。
7.一种权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原在制备预防和/或治疗猪血凝性脑脊髓炎病毒药物或检测猪血凝性脑脊髓炎病毒试剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于s1中s蛋白表达质粒构建的具体方法是：
3.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于s2中293t细胞转染的具体方法是：
4.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，王国平，胡孟军，钟伟超，杨玉玲，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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