【技术实现步骤摘要】
本申请涉及疫苗制备，特别涉及一种双价多糖结合疫苗的制备方法及双价多糖结合疫苗。
技术介绍
1、脑膜炎奈瑟菌是引起细菌性脑膜炎和败血症的主要原因，通常由脑膜炎奈瑟菌血清型a、b、c、y或w135群引起。脑膜炎球菌病的预防包括分离、化学预防和接种疫苗。而针对血清型脑膜炎奈瑟菌的脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗对脑膜炎球菌病的预防非常有效，副作用也最小。脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗是通过化学键的方式将荚膜多糖与各种载体蛋白结合，形成稳定的化学结构，使原本的t细胞非依赖性抗原转变为t细胞依赖性抗原。多糖蛋白结合疫苗能有效地激发2岁以下儿童以及免疫缺陷者的免疫反应与免疫记忆，且保护时间长。相比多糖疫苗，多糖蛋白结合疫苗的覆盖年龄范围更广，免疫效果更好，优势相当明显。因此，采用多价脑膜炎球菌多糖结合疫苗来预防流行性脑膜炎是现如今最佳医疗的策略。
2、但目前多价结合疫苗的生产涉及几个或是很多个单价结合物原液的组装过程，需要将单价结合物原液按不同的比例混合，然后按照制剂配方冻干，这样会导致操作耗时，增加了多个过程，过程越多就需要更多的风险控制点，同时，当结合疫苗价次过高时，传统的混合方法也会对靶抗原的免疫性降低。因此，为降低疫苗制造过程中的风险控制，提高结合疫苗的免疫原性，本申请提出一种新的多糖结合疫苗的制备方法。
技术实现思路
1、本申请的主要目的是提供一种双价多糖结合疫苗的制备方法及双价多糖结合疫苗，旨在解决现有的多糖结合疫苗免疫原性不高的技术问题。
2、为实现上述目的，本申请
3、分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液；
4、分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的ph至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液；
5、在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物；
6、将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物；
7、将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗。
8、可选地，所述脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型a群、c群、y群、x群以及w135群。
9、可选地，所述分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液的步骤，包括：
10、分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液在1000bar-1100bar的压强下，均质10次-15次，得到分子量为5万-9万的第一脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为5万-9万的第二脑膜炎球菌多糖解聚液，于2℃-8℃下保存。
11、可选地，所述分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的ph至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液的步骤，包括：
12、分别在所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液中加入naoh溶液，调节ph为9.5-10.5，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液。
13、可选地，所述在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物的步骤，包括：
14、在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，于2℃-8℃下反应15h-17h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物。
15、可选地，所述连接剂为3臂-peg试剂，所述连接剂的结构式为：
16、。
17、可选地，所述将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
18、在所述双价多糖-linker连接物中加入pbs缓冲液，调节ph为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在3℃-5℃下反应2h-4h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物。
19、可选地，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
20、可选地，所述将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗的步骤，包括：
21、将所述双价多糖-linker-蛋白结合物通过4ff层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于2℃-8℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
22、本申请还提出了一种双价多糖结合疫苗，采用上述双价多糖结合疫苗的制备方法所得。
23、本申请首先将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，适宜的分子量有利于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白的结合，再分别对两种不同的脑膜炎球菌多糖上的羟基进行活化，以便于连接剂通过活化的羟基连接到脑膜炎球菌多糖上，在第一脑膜炎球菌多糖与连接剂形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再与第二脑膜炎球菌多糖进行反应，使得第二脑膜炎球菌多糖同时连接到第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物上，形成双价多糖-linker连接物，这样即可通过一个连接剂同时连接两种不同的多糖，再在缩合剂的催化作用下，使双价多糖-linker连接物与载体蛋白发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物，即可在一个载体蛋白上偶联两种不同的脑膜炎球菌多糖抗原，如此可降低多糖结合疫苗中的蛋白含量，进而避免潜在的载体蛋白所诱导的表位抑制，且本申请通过在一个载体蛋白上偶联两种不同的抗原来增加免疫原性，避免了传统的对单价结合物原液混合的方式所引起的对靶抗原的免疫性降低的问题，且由于载体蛋白含量的大幅减少，其所诱导的表位抑制降低，进而避免了通过增加血清型数量所导致的对竞争性抑制靶点的免疫原性产生影响的问题，从而提高了多糖结合疫苗的免疫原性，同时还可节省载体蛋白的用量，且本申请无需将多个单价结合物原液按不同的比例混合，可以节省疫苗制造工序，从而降低了疫苗制造过程中的风险控制点，有利于制备得到具有更高免疫原性的多糖结合疫苗。
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1.一种双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型A群、C群、Y群、X群以及W135群。
3.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液的步骤，包括：
4.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液的步骤，包括：
5.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物的步骤，包括：
6.根据权利要求5所述的双价多糖结合疫苗的
7.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
8.根据权利要求7所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
9.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗的步骤，包括：
10.一种双价多糖结合疫苗，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的双价多糖结合疫苗的制备方法所得。
...【技术特征摘要】
1.一种双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型a群、c群、y群、x群以及w135群。
3.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液的步骤，包括：
4.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的ph至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液的步骤，包括：
5.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚永鹏，黄杰，魏鑫，许可，张子昌，朱慧，
申请(专利权)人：成都康华生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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