【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子生物学，尤其涉及一种来源于竹节参的糖基转移酶pjugt10及其突变体在生产奥克梯隆型人参皂苷rt5中的应用
技术介绍
1、竹节参是五加科植物panax japonicus c.a.meyer的干燥根茎，药用记载最早出现于清代《本草纲目拾遗》。竹节参具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等传统功效，被土家族和苗族等少数民族聚集区美誉为“草药之王”，常用作人参和三七的替代品。竹节参与同科植物人参、西洋参、三七相似，三萜皂苷类成分(以下统称为“人参皂苷”)是其主要的药效成分。研究表明，人参皂苷具有显著的抗炎、抗肥胖、抗衰老、免疫调节和降血糖等药理作用，已广泛应用于临床研究与药物开发。
2、奥克梯隆型人参皂苷是一种侧链为呋喃环的四环三萜类化合物，主要存在于西洋参、竹节参和珠子参等五加科人参属植物中。鉴于这一类化合物分离制备较为困难，一定程度上限制了其药理活性研究，有限的药理研究表明其具有显著的抗炎、抗菌、拮抗吗啡依赖、促智及预防老年痴呆以及保护心脑血管系统等作用。
3、随着合成生物学的高速发展，利用生物技术手段合成人参皂苷并提高人参皂苷的含量使得这一类药用天然产物脱离原植物，在微生物中生产成为可能。人参皂苷生物合成途径的解析及生物合成基因的挖掘作为代谢工程的基础，是微生物生产稀有人参皂苷中最重要的基本元件。
4、目前已经鉴定了人参来源的ugtpg1可以作用于原人参二醇型人参皂苷c20-oh位点，催化原人参二醇到人参皂苷ck，人参皂苷rg3到人参rd；来源于三七的糖基转移酶pn3-32-
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种来源于竹节参的糖基转移酶pjugt10及其突变体。
2、本专利技术的另一目的在于提供过上述糖基转移酶pjugt10及其突变体在生产奥克梯隆型人参皂苷rt5中的应用。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
4、第一方面，本专利技术请求保护一种竹节参糖基转移酶pjugt10及其突变体，该竹节参糖基转移酶及其突变体为如下(1)～(4)中的至少一种：
5、(1)具有如seq id no.1所示的氨基酸残基序列的蛋白质；
6、(2)如seq id no.1所示的氨基酸残基序列经过位点突变所得到的突变体；所述的位点突变为h82a、h82c、h144f、m188a、f200l、v348m、g352a、l360v、c374y、h412y、h82c/h144f、v348m/g352a、g352a/l360v或l360v/c374y；
7、(3)与(1)中所述氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有相同酶功能的由(1)中所述氨基酸序列衍生的蛋白质；或为(1)或(2)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有糖基转移酶活性的衍生蛋白质；
8、(4)在(1)或(2)中所述氨基酸序列的n或c端具有标签序列或者信号肽序列的蛋白质。
9、第二方面，本专利技术请求保护编码上述竹节参糖基转移酶及其突变体的基因。
10、进一步，该基因的核苷酸序列为如下(a)或(b)：
11、(a)如seq id no.2所示核苷酸序列；
12、(b)与如seq id no.2所示核苷酸序列具有80％以上同源性且编码具有合成拟人参皂苷rt5功能的糖基转移酶的核苷酸序列。
13、第三方面，本专利技术请求保护含有上述编码竹节参糖基转移酶及其突变体基因的生物材料，该生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
14、进一步，所述的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体为将上述编码竹节参糖基转移酶及其突变体的基因插入原核或真核表达载体得到的表达糖基转移酶的重组表达载体。本专利技术的其中一个实施例中，所述的重组表达载体是将如seq id no.2所示的核苷酸序列插入pcoldtf载体的bamhi和hindiii酶切位点间而得到的，但不限于此。
15、进一步，所述的转基因重组菌是将上述的编码竹节参糖基转移酶及其突变体的基因或上述的重组表达载体转入工程菌中得到的。所述的工程菌为真菌或其他细菌，包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母；本专利技术的其中一个实施例中，工程菌为bl21(de3)，但不限于此。
16、第四方面，本专利技术请求保护上述的竹节参糖基转移酶及其突变体，上述的编码竹节参糖基转移酶及其突变体的基因，或上述的生物材料在生产拟人参皂苷rt5中的应用。
17、进一步，该应用为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：
18、(ⅰ)采用上述的竹节参糖基转移酶及其突变体体外催化底物奥克梯隆型人参皂苷生产拟人参皂苷rt5；
19、(ⅱ)将上述的转基因重组菌添加至含有底物奥克梯隆型人参皂苷的反应体系中，进行反应，制备得到拟人参皂苷rt5；
20、(ⅲ)采用上述的转基因重组菌发酵生产拟人参皂苷rt5，向发酵液中直接投喂底物奥克梯隆型人参皂苷以生产拟人参皂苷rt5。
21、第五方面，本专利技术请求保护一种生产拟人参皂苷rt5的方法，该方法为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：
22、(ⅰ)采用上述的竹节参糖基转移酶及其突变体体外催化底物奥克梯隆型人参皂苷生产拟人参皂苷rt5；
23、(ⅱ)将上述的转基因重组菌添加至含有底物奥克梯隆型人参皂苷的反应体系中，进行反应，制备得到拟人参皂苷rt5；
24、(ⅲ)采用上述的转基因重组菌发酵生产拟人参皂苷rt5，向发酵液中直接投喂底物奥克梯隆型人参皂苷以生产拟人参皂苷rt5。
25、进一步，(ⅰ)中所述体外催化的酶促反应温度为10-40℃(优选为10-35℃；进一步优选为25-35℃)，ph 5.0-10.0(优选为ph 5.0-8.0；更进一步优选为ph 6.0-8.0；更进一步优选为ph 7.0-8.0)。
26、本专利技术的具体实施例中，采用竹节参糖基转移酶pjugt10催化生产拟人参皂苷rt5的方法，具体包括如下步骤：
27、(1)将所述的转基因工程菌进行发酵培养，收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后收集上清液，分离纯化蛋白；
28、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种竹节参糖基转移酶及其突变体，其特征在于：该竹节参糖基转移酶及其突变体为如下(1)～(4)中的至少一种：
2.编码权利要求1所述竹节参糖基转移酶及其突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列为如下(a)或(b)：
4.含有如权利要求2或3所述基因的生物材料，其特征在于：该生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体为将权利要求2或3所述的基因插入原核或真核表达载体得到的表达糖基转移酶及其突变体的重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述的转基因重组菌是将权利要求2或3中所述的基因或权利要求4或5中所述的重组表达载体转入工程菌中得到的。
7.权利要求1中所述的竹节参糖基转移酶及其突变体，权利要求2或3中所述的基因，或权利要求4～6中任一所述的生物材料在生产拟人参皂苷RT5中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：该应用为如
9.一种生产拟人参皂苷RT5的方法，其特征在于，该方法为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，(Ⅰ)中所述体外催化的酶促反应温度为10-40℃，pH 5.0-10.0。
...【技术特征摘要】
1.一种竹节参糖基转移酶及其突变体，其特征在于：该竹节参糖基转移酶及其突变体为如下(1)～(4)中的至少一种：
2.编码权利要求1所述竹节参糖基转移酶及其突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列为如下(a)或(b)：
4.含有如权利要求2或3所述基因的生物材料，其特征在于：该生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体为将权利要求2或3所述的基因插入原核或真核表达载体得到的表达糖基转移酶及其突变体的重组表达载体。
6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：王如锋，李鹏飞，王峥涛，杨莉，牛腾飞，杨小林，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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