【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种重组mil13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建及蛋白纯化方法。
技术介绍
1、白介素il-13是一种免疫调节细胞因子，主要由活化的th2细胞分泌，在调节炎症、免疫反应和疾病中起关键作用，此外，它还抑制促炎细胞因子和趋化因子的产生，从而下调巨噬细胞的活性。il13蛋白更重要的是在各种细胞类型中作为免疫调节过程的中心介质，目前该蛋白的表达仍以原核表达为主，但是原核表达的蛋白存在活性低的问题，哺乳动物细胞表达的产能极低，同时瞬转产能极不稳定。在基因功能的研究中，稳定表达细胞株可以弥补瞬时感染(或转染)实验中外源基因表达时间短的缺陷，便于长期观察蛋白间相互作用以及基因对细胞功能的影响，同时其稳定性更好和批间差异更小，是开展基因功能研究、靶点验证及药物筛选的重要工具。
2、稳转细胞株的构建一般分为脂质转染法和病毒转染法，脂质体转染法存在转染周期长且效率低的问题，慢病毒转染筛选稳定细胞株具有更高的效率且适用于大部分难转染的细胞，是构建稳定细胞株的理想方法。然而现有的慢病毒转染工艺大多是采用依赖牛血清(fbs)的贴壁细胞工艺(如hek293t)，其往往存在以下弊端：(1)使用动物来源的血清，增加了外源病毒因子污染的风险，并且血清成分复杂、组分不明确，不符合药品生产注册的监管精神；(2)肽牛血清(fbs)批次及产地容易存在较大差异，其会导致所表达的慢病毒存在批间差异；(3)消化贴壁细胞使用动物来源的胰蛋白酶，可能引入外源病毒因子，增加质控难度等问题；(4)贴壁细胞工艺多数为细胞工厂，因此工艺难
3、目前，基于thermo公司的lv-max慢病毒表达系统虽然可以达到高滴度的慢病毒，但其培养基和转染试剂昂贵，生产中难以大规模使用。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术提供了一种重组mil13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建方法，该方法不仅解决了贴壁细胞依赖fbs和难以放大生产的缺点，也避免了慢病毒商业化表达系统成本昂贵、操作复杂的缺点，同时能快速高效获得稳定细胞株，提高产能，降低重组蛋白的生产成本并且能获得较高的活性。
2、本专利技术采用如下技术方案来实现上述目的：重组mil13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：
3、s1，将mil13基因插入plvx-acgfp1-n1慢病毒转移载体质粒中构建得到mil13重组慢病毒转移载体质粒；
4、s2，将转染试剂pei max用opti-mem培养基稀释后室温孵育4～5min，将每1ml细胞需要的总质粒量2.0～2.5μg按照mil 13重组慢病毒转移载体质粒：病毒包装辅助质粒pcmv-vsv-g：prsv-rev：pspax2＝(1.5～2.0)：1：1：1的质量比同样用opti-mem培养基稀释；
5、将上述稀释后的质粒与孵育后的转染试剂混匀，室温继续孵育10～20min得dna-pei max复合物，其中，peimax的用量与总质粒的质量比为(2～3):1；
6、将dna-pei max复合物加入到生长良好的活细胞密度为3.5～4.0×106cells/ml的hek293f细胞中并用opm-293cd05细胞培养基悬浮培养；
7、转染16～20h后添加1～10mm丁酸钠和体积比为3～5％的opm-293profeed，转染48～55h后离心收获慢病毒，过滤除去细胞碎片，即得mil13重组慢病毒液；
8、s3，将mil13重组慢病毒液感染哺乳动物细胞，用opm-293cd05培养基悬浮培养并用嘌呤霉素筛选即得。
9、作为一种优选的实施方式，步骤s1中mil13重组慢病毒转移载体质粒的构建方法如下：将编码mil13的ser26-phe131的氨基酸序列的5’端添加kozak序列及信号肽序列metdtlllwvlllwvpgstg并合成，然后插入到载体plvx-acgfp1-n1中，构成重组慢病毒转移载体plvx-mil13；
10、将重组慢病毒转移载体plvx-mil13与包装质粒pcmv-vsv-g、prsv-rev、pspax2分别转化到大肠杆菌感受态细胞中，得到单菌落；挑取单菌落培养后，用无内毒素质粒试剂盒抽提得到无内毒素的重组慢病毒转移载体plvx-mil13、pcmv-vsv-g、prsv-rev、pspax2。
11、作为一种优选的实施方式，，所述大肠杆菌感受态细胞包括但不限于stbl3、top10和dh5α。
12、作为一种优选的实施方式，步骤s2中，hek293f细胞的制备方法如下：转染前一天，将p4～p20代次内、活细胞密度为3.5～5.5×106cells/ml且细胞活力＞97％的hek293f细胞用opm-293cd05培养基稀释至2.5×106cells/ml，然后再传代培养24h；转染当天，将活细胞密度稀释至3.5～4.0×106cells/ml备用。
13、作为一种优选的实施方式，过滤除去细胞碎片时所用的滤膜孔径为0.45μm。
14、作为一种优选的实施方式，步骤s3中，哺乳动物细胞为expi293f细胞，expi293f细胞的制备方法如下：感染前一天，将p4～p20代次内，活细胞密度密度为3.0～5.0×106cells/ml且细胞活力>97％的细胞用opm-293cd05培养基稀释至活细胞密度2.0×106cells/ml，然后再传代培养24小时；转染当天，离心收集细胞并按照每5.0×106个活细胞添加3±0.5ml培养基的比例制备细胞悬液。
15、作为一种优选的实施方式，步骤s3中，expi293f细胞悬液中添加有聚凝胺。
16、作为一种优选的实施方式，步骤s3中，筛选方法为：感染72h后，对细胞进行计数，离心后加入新鲜的培养基并按照每1.0×106cells/ml加入1μg/ml嘌呤霉素的比例添加嘌呤霉素；每2～3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养基一次，筛选4次后，将感染并筛选后的细胞进行传代，并施加嘌呤霉素进行维持性筛选培养，连续筛选并传代3次后，即得。
17、本专利技术还提供了上述mil13蛋白质的纯化方法，包括以下步骤：构建含有组氨酸标签的mil13重组慢病毒转移载体质粒，并按照上述的方案构建得到细胞株，将构建得到的细胞株培养后进行离心并收集上清；采用亲和层析方法对目标蛋白进行分离纯化。
18、作为一种优选的实施方式，亲和层析所用的填料为ni-nta，平衡缓冲液为：20mmtris-hcl，250mm nacl，10mm咪唑，10％甘油，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组mIL13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中mIL13重组慢病毒转移载体质粒的构建方法如下：将编码mIL13的Ser26-Phe131的氨基酸序列的5’端添加Kozak序列及信号肽序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG并合成，然后插入到载体pLVX-AcGFP1-N1中，构成重组慢病毒转移载体pLVX-mIL13；
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞包括但不限于Stbl3、TOP10和DH5α。
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，HEK293F细胞的制备方法如下：转染前一天，将P4～P20代次内、活细胞密度为3.5～5.5×106cells/mL且细胞活力＞97％的HEK293F细胞用OPM-293CD05培养基稀释至2.5×106cells/mL，然后再传代培养24h；转染当天，将活细胞密度稀释至3.5～4.0×106cells/mL备用。
5.根据权利要求1～3
6.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，哺乳动物细胞为Expi293F细胞，Expi293F细胞的制备方法如下：感染前一天，将P4～P20代次内，活细胞密度密度为3.0～5.0×106cells/mL且细胞活力>97％的细胞用OPM-293CD05培养基稀释至活细胞密度2.0×106cells/mL，然后再传代培养24小时；转染当天，离心收集细胞并按照每5.0×106个活细胞添加3±0.5mL培养基的比例制备细胞悬液。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，Expi293F细胞悬液中添加有聚凝胺。
8.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，筛选方法为：感染72h后，对细胞进行计数，离心后加入新鲜的培养基并按照每1.0×106cells/mL加入1μg/mL嘌呤霉素的比例添加嘌呤霉素；每2～3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养基一次，筛选4次后，将感染并筛选后的细胞进行传代，并施加嘌呤霉素进行维持性筛选培养，连续筛选并传代3次后，即得。
9.mIL13蛋白质的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：构建含有组氨酸标签的mIL13重组慢病毒转移载体质粒，并按照权利要求1～8任一项所述的方案构建得到细胞株，将构建得到的细胞株培养后进行离心并收集上清；采用亲和层析方法对目标蛋白进行分离纯化。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，亲和层析所用的填料为Ni-NTA，平衡缓冲液为：20mM Tris-HCL，250mM NaCl，10mM咪唑，10％甘油，pH 8.0；
...【技术特征摘要】
1.重组mil13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中mil13重组慢病毒转移载体质粒的构建方法如下：将编码mil13的ser26-phe131的氨基酸序列的5’端添加kozak序列及信号肽序列metdtlllwvlllwvpgstg并合成，然后插入到载体plvx-acgfp1-n1中，构成重组慢病毒转移载体plvx-mil13；
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞包括但不限于stbl3、top10和dh5α。
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，hek293f细胞的制备方法如下：转染前一天，将p4～p20代次内、活细胞密度为3.5～5.5×106cells/ml且细胞活力＞97％的hek293f细胞用opm-293cd05培养基稀释至2.5×106cells/ml，然后再传代培养24h；转染当天，将活细胞密度稀释至3.5～4.0×106cells/ml备用。
5.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，过滤除去细胞碎片时所用的滤膜孔径为0.45μm。
6.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤s3中，哺乳动物细胞为expi293f细胞，expi293f细胞的制备方法如下：感染前一天，将p4...
【专利技术属性】
技术研发人员：周雪莉，马雁，宋从进，余建敏，王朝，赵中梳，张福城，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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