一种基于ＡＦ１４６５２７基因的弓形虫ＰＣＲ检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫ＰＣＲ检测方法。以弓形虫基因组ＤＮＡ为模板，采用本发明专利技术设计的引物，以本发明专利技术优化的ＰＣＲ体系和条件进行ＰＣＲ反应，扩增高度重复的弓形虫特定的ＡＦ?１４６５２７基因的部分片段，可快速、特异、敏感地检测出样本中的弓形虫，为人类和动物弓形虫病的筛查与临床诊断及流行病学调查简单、快速、准确的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种弓形虫PCR检测方法。技术背景弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，可寄生于除红细胞外的所有有核细胞内，可感染包括人类在内的所有温血动物(da Silva RC，Langoni H.Parasitol Res，2009，105(4)：893-898.)。它引起的弓形虫病是一种严重的人兽共患病，其传播与流行传播与流行给畜牧业生产(特别是带来养猪业)巨大的损失(Dorny P，PraetN，Deckers N，et al.Vet Parasitol，2009，163(3)：196-206；Dubey JP.Vet Parasitol，2009，164(2-4)：89-103.)；同时，对于妊娠妇女、AIDS患者，骨髓移植患者、器官移植受者以及包括肿瘤患者在内的免疫力低下群体，弓形虫病则会导致严重的后果，对人类健康存在很大的潜在危害，其防治在艾滋病、移植医学、围产医学等学科中备受关注(Ong EL.Clin Med，2008，8(5)：539-543；Pereira-Chioccola VL，Vidal JE，Su C.Future Microbiol，2009，4：1363-1379；PeyronF.Mem Inst Oswaldo Cruz，2009，104(2)：316-319；Derouin F，Pelloux H；ESCMIDStudy Group on Clinical Parasitology.Clin Microbiol Infect，2008，14(12)：1089-1101)。在临床上，弓形虫感染多为隐形感染，难以用传统常规方法侦检；及时出现临床症状的患者，由于其临床症状复杂多变，且多同时伴有其他病变，亦往往造成诊断困难。目前，弓形虫感染的诊断方法主要为免疫学诊断方法，检测弓形虫抗体，但往往弓形虫病患者伴有免疫功能低下，对于这部分免疫功能低下的患者，往往会出现抗体水平的下降，难以用免疫学方法诊断。而普通病原学检测方法如直接涂片法的检出率低下，动物接种和细胞培养法尽管检出率高，但操作繁琐，周期长，并不适合用于临床诊断。PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏的特点。关于弓形虫的PCR诊断方法，国内外学者已经进行了大量的研究，其中B1基因、P30基因及ITS-1基因等均曾被作为PCR诊断的标靶。弓形虫基因组中存在一个529bp的重复序列(AF 146527基因)，其基因组中的拷贝数高达200～300，远远高于上述的PCR诊断标靶，因此，以其作为PCR诊断的标靶可以提高诊断的灵敏性(Homan W L，Vercammen M，DeBraekeleer J，et al.International Journal for Parasitology，2000，30：69-75)。国外学者曾利用该重复序列为标靶建立荧光定量PCR诊断方法，获得较为理想的效果(Homan W L，Vercammen M，De Braekeleer J，et al.International Journal forParasitology，2000，30：69-75；Edvinsson B，Lappalainen M，B，et al.ClinMicrobiol Infect，2006，12(2)：131-136.)。但荧光定量PCR的设备及试剂成本较高，因此，本领域需要一种敏感特异的普通PCR检测方法，以满足实际工作中弓形虫感染诊断的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测弓形虫的PCR方法，通过以下技术方案实现：(1)设置PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、EB-->染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)；(2)提取被检样本DNA；(3)PCR扩增；(4)扩增产物分析；其中(1)的PCR反应管内含10×缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgCl2，所述引物1、引物2系根据弓形虫AF146527基因序列(SEQ ID NO.1)设计合成的DNA片段，序列如下：引物1  5’-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3’(SEQ ID NO.2)引物2  5’-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3’(SEQ ID NO.3)。所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建：将以弓形虫基因组DNA为模板，以引物Tox4[5’-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3’(SEQ ID NO.4)]、引物Tox5[5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3’(SEQ ID NO.5)]扩增获得的PCR产物连接于pMD18-T载体后经测序验证获得的阳性质粒，该质粒含有弓形虫AF146527基因片段；所述阴性对照为去离子水；其中步骤(2)所述提取被检样品DNA，可采用《分子克隆》描述的经典方法提取，亦可使用上海飞捷生物公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取(或其他生物公司的DNA提取试剂盒提取)；其中步骤(3)所述的PCR扩增是在PCR管中加入步骤(2)提取的被检样本DNA，同时设阳性对照和阴性对照，反应体系为：10×buffer 5μl，10mM dNTP0.25～1.5μl，25mM MgCl22～5μl，引物1(50pmol/μl)1μl，引物2(50pmol/μl)1μlTaq酶(1U/μl)1μl，模板DNA 1μl，加去离子水补足至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，56～63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循环30～45次，最后72℃延伸10min。优选反应体系为10×buffer 5μl，10mM dNTP 1μl，25mM MgCl22μl，引物1(50pmol/μl)1μl，引物2(50pmol/μl)1μl，Taq酶(1U/μl)1μl，模板DNA1μl，加去离子水补足至50μl。优选反应条件为94℃预变性5min后，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循环30次，最后72℃延伸10min。其中步骤(4)所述扩增产物分析，是将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，被检样本孔出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照孔对比，以判断阳性或阴性。利用本专利技术优选的PCR反应体系与反应条件，最低可检出10个拷贝AF146527基因(即0.03～0.05个虫体)，具有高度的敏感性；同时，本专利技术对正常小鼠全血、健康志愿者全血、间日疟原虫、恶性疟原虫及结核杆菌的基因组DNA扩增均为阴性，仅扩增弓形虫基因组DNA结果为阳性，具有高度的特异性。本专利技术的优点是提供了一种基于弓形虫基因组中高度重复的AF146527基因的检测弓形虫的PCR检测方法，可快速、敏感、特异地检测被检样本中的弓形虫存在与否，适用于人类和动物弓形虫感染的筛查、临床诊断及流行病学调查。附图说明图1本专利技术PCR方法的特异性实验电泳图。1：弓形虫；2：正常小鼠全血；3：正常人全血；4：间日疟原虫；5：恶性疟原虫；6：结核杆菌；M：DNAmarker-->图2本专利技术PCR方法的敏感性实验电泳图。1～7：分别为10、102、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测弓形虫的ＰＣＲ方法，其特征包括以下步骤：　　（１）设置ＰＣＲ检测试剂盒，试剂盒包括ＰＣＲ反应管、阳性对照、阴性对照、Ｔａｑ酶、ＥＢ染料、溴酚蓝上样缓冲液（常规浓度）；（２）提取被检样本ＤＮＡ；（３）ＰＣＲ扩增；（４）扩增产物分析；其中步骤（１）的ＰＣＲ反应管内含１０×缓冲液、ｄＮＴＰ、引物１、引物２和ＭｇＣｌ２，所述引物１、引物２系根据下述碱基合成的ＤＮＡ片段：　　引物１　５’－ＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧ－３’　　引物２　５’－ＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＡＡＧＣ－３’　　所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建：将以弓形虫基因组ＤＮＡ为模板，以引物Ｔｏｘ４（５’ＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＴＴＧ－３’）、引物Ｔｏｘ５（５’－ＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴ－３’）扩增获得的ＰＣＲ产物连接于ｐＭＤ１８－Ｔ载体后经测序验证获得的阳性质粒，该质粒含有弓形虫ＡＦ１４６５２７基因片段；　　所述阴性对照为去离子水；　　其中步骤（２）所述提取被检样品ＤＮＡ，可采用《分子克隆》描述的经典方法提取，亦可使用上海飞捷生物公司的基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒提取（或其他生物公司的ＤＮＡ提取试剂盒提取）；　　其中步骤（３）所述的ＰＣＲ扩增是在ＰＣＲ管中加入步骤（２）提取的被检样本ＤＮＡ，同时设阳性对照和阴性对照，反应体系为：１０×ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ，１０ｍＭ　ｄＮＴＰ０．２５～１．５μｌ，２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２２～５μｌ，引物１（５０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ，引物２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ，Ｔａｑ酶（１Ｕ／μｌ）１μｌ，模板ＤＮＡ１μｌ，加去离子水补足至５０μｌ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ后，９４℃变性３０ｓ，５６～６３℃退火３０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，共循环３０～４５次，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；　　其中步骤（４）所述扩增产物分析，是将ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，被检样本孔出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照孔对比，以判断阳性或阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种检测弓形虫的PCR方法，其特征包括以下步骤：(1)设置PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、EB染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)；(2)提取被检样本DNA；(3)PCR扩增；(4)扩增产物分析；其中步骤(1)的PCR反应管内含10×缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgCl2，所述引物1、引物2系根据下述碱基合成的DNA片段：引物1  5’-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3’引物2  5’-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3’所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建：将以弓形虫基因组DNA为模板，以引物Tox4(5’CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3’)、引物Tox5(5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATTT-3’)扩增获得的PCR产物连接于pMD18-T载体后经测序验证获得的阳性质粒，该质粒含有弓形虫AF146527基因片段；所述阴性对照为去离子水；其中步骤(2)所述提取被检样品DNA，可采用《分子克隆》描述的经典方法提取，亦可使用上海飞捷生物公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取(或其他生物公司的DNA提取试剂盒提取)；其中步骤(3)所述的PCR扩增是在PCR管中加入步骤(2)提取的被检样本DNA，同时设阳性对照和阴...

【专利技术属性】
技术研发人员：方强，沈继龙，陈兴智，徐家森，王雪梅，夏惠，齐文娟，孙新，
申请(专利权)人：蚌埠医学院，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]