【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器领域，具体是一种诃子酸核酸适配体免标记生物传感器。
技术介绍
1、诃子酸是一种植物提取物，其具有多种生物活性，例如抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。近年来，诃子酸的生理功能和药用功效获得巨大关注，检测诃子酸的需求也涉及不同领域和应用，包括药物研发、药物及保健品研究、环境监测、质量控制等。
2、核酸适配体于1990年被ellington和szostak首次通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex）体外筛选得到。在随后三十年的发展中，越来越多的核酸适配体被分离得到，其能够以亲和、特异的方式结合靶标分子。在检测方面，核酸适配体生物传感器近年来发展迅猛，能够以靶标响应的模式产生输出信号，且其性质稳定，便于运输和存储。但是，一些适配体传感器需要修饰信号输出分子，这会致使成本提高并影响核酸的折叠动力学。硫黄素t（thioflavin t，tht）是一种小分子荧光染料，可以嵌入特殊核酸构象中产生较高的荧光量子产率，例如g-四链体、发夹结构或b-dna双链等。
3、本专利技术提出了一种通过selex筛选得到的诃子酸核酸适配体，并基于适配体成功构建了一种诃子酸核酸适配体免标记生物传感器，最终实现了诃子酸快速、低成本、超灵敏的免标记荧光检测。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术提出了一种诃子酸核酸适配体，并且成功构建了一种诃子酸核酸适配体免标
2、一方面，本申请提出了一种诃子酸核酸适配体。
3、所述诃子酸核酸适配体序列为：5’- cgggcggatgggtcaggagcatggaagcttgggattgcggctagggaaggtggca -3’，如seq id no:1所示，或与seq id no:1中所示的核苷酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且结合诃子酸的核苷酸序列，例如可将seq id no:1中所示的核苷酸序列删除部分序列或增加部分序列。
4、另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合诃子酸的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
5、所以，在一些实施方案中，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体结合诃子酸，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
6、在另一方面，本专利技术还提供诃子酸核酸适配体的缀合物。
7、本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质例如fam、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶标记等中的至少一种，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合诃子酸的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
8、换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与诃子酸的结合。
9、因此，本专利技术提供核酸适配体的缀合物，其特征在于其为在根据所述核酸适配体（如seq id no:1所示）的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物结合诃子酸，所述物质是荧光标记物例如fam、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记中的至少一种。
10、另一方面，上述核酸适配体（如seq id no:1所示）或其缀合物在诃子酸检测方法开发、试剂盒制备、药物研发或环境检测中的应用。
11、另一方面，本申请开发了一种诃子酸核酸适配体免标记生物传感器，其特征在于，所述免标记生物传感器包括：（1）诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的序列；（2）诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的信号报告分子；
12、所述诃子酸核酸适配体免标记生物传感器序列为：5’- cgggcggatgggtcaggagcatggaagcttgggattgcggctagggaaggtggca -3’，如seq id no:1所示；
13、所述诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的信号报告分子为tht荧光染料；
14、所述诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的溶液中tht荧光染料的浓度为2.5 μmol·l-1；
15、所述诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的缓冲溶液为：10 mmol·l-1tris-hcl,10 mmol·l-1mgcl2, 20 mmol·l-1kcl, 1 mmol·l-1dtt, ph 7.4；
16、所述诃子酸的检测是基于诃子酸的加入使tht荧光信号强度发生变化实现的，特定激发条件下的tht荧光值与溶液中诃子酸浓度呈现梯度变化，进而实现诃子酸的检测；
17、具体的标准曲线建立步骤：
18、将不同浓度的诃子酸和2.5 μmol·l-1tht同时加入至包含1 μmol·l-1适配体溶液的缓冲溶液（10 mmol·l-1tris-hcl, 10 mmol·l-1mgcl2, 20 mmol·l-1kcl, 1 mmol·l-1dtt, ph 7.4）中，使诃子酸的终浓度分别为0，1，2，5，10，15，20，30，50 μmol·l-1，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系中tht的荧光强度（激发波长443 nm，发射波长477 nm），基于荧光值和诃子酸浓度绘制标准曲线。结果显示，诃子酸核酸适配体免标记传感器在1~50 μmol·l-1诃子酸浓度范围内具有良好线性关系（r2=0.991），线性回归方程为y=-1.260 x + 248.6，检出限低至8.29 nmol·l-1。
19、另一方面，涉及该生物传感器在诃子酸检测方法开发或环境检测中的应用。
20、另一方面，本专利技术提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如seq id no:1所示的核酸适配体或其缀合物。
21、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
22、1、本专利技术提出了一种通过selex筛选得到的诃子酸核酸适配体，其亲和性较好，亲和常数为2.770 μmol·l-1；
23、2、本专利技术提出的诃子酸核酸适配体免标记生物传感器能够实现快速、低成本、稳定和超灵敏的诃子酸免标记检测，具有一定的通用性和产业化潜力；<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诃子酸核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：5’- CGGGCGGATGGGTCAGGAGCATGGAAGCTTGGGATTGCGGCTAGGGAAGGTGGCA -3’，如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的诃子酸核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体结合诃子酸，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
3.诃子酸核酸适配体的缀合物，其特征在于，所述缀合物为在根据权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物结合诃子酸，所述物质是荧光标记物例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶标记中的至少一种。
4.一种诃子酸核酸适配体免标记生物传感器，其特征在于，所述免标记生物传感器包括：（1）诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的序列；（2）诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的信号报告分子；
5.根据权利要求
6.根据权利要求4~5所述的诃子酸核酸适配体免标记生物传感器对诃子酸进行定量检测的方法，其特征在于，标准曲线的建立：
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物。
8.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物在诃子酸检测方法开发、试剂盒制备、药物研发或环境检测中的应用。
9.权利要求4~6任一项所述的生物传感器在诃子酸检测方法开发或环境检测中的应用。
10.权利要求7所述的试剂盒在诃子酸检测方法开发或环境检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种诃子酸核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：5’- cgggcggatgggtcaggagcatggaagcttgggattgcggctagggaaggtggca -3’，如seq id no:1所示。
2.根据权利要求1所述的诃子酸核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体结合诃子酸，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
3.诃子酸核酸适配体的缀合物，其特征在于，所述缀合物为在根据权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物结合诃子酸，所述物质是荧光标记物例如fam、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记中的至少一种。
4.一种诃子酸核酸适配体免标记生物传感器，其特征在于，所述免标记生物传感器包括：（1）诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的序列；（2）诃子酸核酸适配体免标记生物传感器的信号报告分子；
【专利技术属性】
技术研发人员：丁自勉，许文涛，陈可仁，邹忠梅，武晓丽，朱龙佼，马婷玉，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。