一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法技术

本发明专利技术公开了一种新型的蛋白质糖基化接枝方法，包括如下步骤：（１）在拥挤试剂中加入缓冲溶液，搅拌，得到溶液；（２）将蛋白和葡聚糖加入步骤（１）得到的溶液中，搅拌２ｈ后，加入ＮａＮ３，在５℃放置２４ｈ，再在５０～７０℃搅拌１２～４８ｈ后，迅速冷却至低于２５℃，得到糖基化蛋白产物；本发明专利技术操作方便，反应效率高，接枝物其水溶性、乳化性、抗氧化性等功能性质有很大的提高，产品具有工业化、规模化的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品领域，涉及蛋白改性的方法，特别涉及一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法。
技术介绍
蛋白质和多糖是共存于食品乳化体系中最重要的两类生物大分子，是影响食品结构和质构的主要因素。蛋白质因能在液液或气液界面上形成吸附层来降低界面张力而多在胶体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的增稠和持水特性而常用做稳定剂，由此赋予了体系不同于两者单独存在时的功能表现。共价键结合的蛋白质与多糖形成接枝物，既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能，与蛋白质多糖弱相互作用形成的混合物对比，对环境条件(温度、pH值、离子强度等)具有较高的适应性。通过自发的Maillard反应使蛋白质的ε-氨基基团与多糖的还原性羰基末端结合，可以得到具有优越功能性质的蛋白质糖基化接枝物。到目前为止，有效的制备方法依然是干热法，其原理是通过在较低的水分活度下蛋白质中的氨基处于非聚集的反应状态，如此以提供反应基团与多糖发生共价结合。但是干热法具有反应时间长，Maillard反应程度不可控制等自身的缺陷。在食品工业中，食品科学家们经常希望反应发生在自由的水相中，而传统的水溶液中发生Maillard反应生成糖基化蛋白的同时也会使蛋白分子变性以及产生蛋白聚集。因此，到目前为至，始终无法使多糖与蛋白的Maillard反应在水溶液中有效进行。“大分子拥挤”(macromolecular crowding)是生命科学领域中全新的概念，近几年科学家强烈建议把“大分子拥挤”环境与pH、离子强度和溶液组成等因素一样作为常规因素来研究生物大分子。当体系中存在有高浓度的生物大分子时，大分子之间的反应遵循分子排斥容积理论(excluded volume effect)，促进反应向溶质总体积减小的方向，即朝结合方向移动；另外，大分子拥挤环境下蛋白分子构型趋于稳定，蛋白变性程度以及聚集程度将会减轻。由此，本项目提出将多糖和蛋白质作为生物大分子处于大分子拥挤环境中，蛋白能够处于非变性或少聚集的反应状态，与多糖的Maillard反应也将在水溶液中向着形成共价结合的反应途径进行。本专利技术将生命科学中的“大分子拥挤”环境应用于生成蛋白多糖功能性大分子，根据大分子拥挤环境下的分子排斥容积理论，水溶液中的蛋白与多糖将优先向着结合的方向进行，同时使得在此环境中蛋白发生聚集或变性的几率大大降低，而作为“拥挤试剂”的大分子，可以是惰性高聚物，也可以是同时参与反应的多糖。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的蛋白质糖基化接枝方法。本专利技术模拟生命科学领域的大分子拥挤体系，体系中的拥挤试剂可以是惰性高聚物或葡聚糖。该法具有操作方便、反应时间短、性能稳定、所得产物没有产生褐变等优点，产品具有良好的工业化、规模化的应用前景，该方法克服了现有蛋白质和糖接枝方法难以实现工业化的缺陷。-->本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法，包括以下步骤：(1)在拥挤试剂中加入缓冲溶液，搅拌，得到溶液；(2)将蛋白和葡聚糖加入步骤(1)得到的溶液中，搅拌2h后，加入NaN3，在5℃放置24h，再在50～70℃搅拌12～48h后，迅速冷却至低于25℃，得到糖基化蛋白产物；所述拥挤试剂的质量份数为10～40份，蛋白的质量份数为1～10份，蛋白与多糖的质量比为1∶3～1∶6。所述蛋白为大豆酸沉蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麦面筋蛋白。所述拥挤试剂为高分子惰性聚合物或多糖。所述拥挤试剂为高分子惰性聚合物，例如；Ficol1 70或PEG2000。所述拥挤试剂为多糖，例如：Dextran 70、Dextran 10或Dextran 40。所述缓冲溶液是pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法，包括以下步骤：(1)将蛋白和拥挤试剂溶解于缓冲溶液，搅拌2h后，加入NaN3，(2)在5℃放置24h，再在50～70℃搅拌12～48h后，迅速冷却至低于25℃，得到糖基化蛋白产物；蛋白与拥挤试剂的质量比为1∶3～1∶6。所述蛋白为大豆酸沉蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麦面筋蛋白。所述拥挤试剂为多糖。例如：Dextran 70、Dextran 10或Dextran 40。所述缓冲溶液是pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液。本专利技术所述的方法制备的糖基化蛋白产物。所述的糖基化蛋白产物在制备改性蛋白或食品添加剂中的应用。所述的糖基化蛋白产物可以不纯化或者利用凝胶过滤色谱纯化除去未反应的蛋白和葡聚糖以及惰性高聚物。本专利技术原理如下：通过自发的Maillard反应使蛋白质的ε-氨基基团与多糖的还原性羰基末端结合，可以得到具有优越功能性质的蛋白糖基化共价接枝物。因此在反应过程中选用反应接枝程度作为检测指标。接枝度采用OPA法即邻苯二甲醛方法测定反应液中自由氨基的含量，反映出接枝改性的程度，其原理是依据OPA与蛋白质中的自由氨基在β-巯基乙醇的存在下，生成的化合物在340nm处有吸收，据此利用分光光度法可计算出反应液中的自由氨基含量，以反应接枝改性的程度。本专利技术采用“大分子拥挤环境”作为生成糖基化蛋白的反应体系，通过将生命科学领域中拥挤理论对蛋白质结构稳定的科学现象进一步应用于蛋白质糖基化接枝物的制备。大分子拥挤环境能够使蛋白分子在水溶液中同样处于非聚集或者较少聚集的反应状态，同时，促进蛋白与多糖的反应向着共价结合的方向进行。本专利技术相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：-->(1)在本专利技术中，大豆蛋白与多糖的共价接枝，不需要任何化学试剂作为催化剂，仅在水相溶液中在温和的温度下进行，模拟生命科学领域中的“大分子拥挤环境”进行蛋白质的糖基化反应；反应速度较快，产物颜色呈乳白色；(2)水相反应中可以自由搅拌反应，克服了干热反应中反应不均匀的缺点，最大程度地多糖和蛋白质充分接触；(3)与其他接枝改性方法相比，本专利技术具有规模化的应用前景，工业可操作性强。具体实施方式：实施例1：准确称取0.5g大豆蛋白、1.5g葡聚糖，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，室温搅拌2h后，加入3滴NaN3(0.02％w/w)防腐，在5℃放置24h，恒温60℃，搅拌速度为500r/min条件下搅拌30h。反应结束后，迅速冷却至室温终止反应，冷冻干燥，得到糖基化蛋白产物。对比实施例1-1：准确称取0.5g大豆蛋白，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，室温搅拌2h后，加入3滴NaN3(0.02％w/w)防腐，在5℃放置24h，恒温60℃，搅拌速度为500r/min条件下搅拌30h。反应结束后，迅速冷却至室温终止反应，冷冻干燥。对比实施例1-2：准确称取0.01g大豆蛋白、0.03g葡聚糖，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，室温搅拌2h后，加入3滴NaN3(0.02％w/w)防腐，在5℃放置24h，恒温60℃，搅拌速度为500r/min条件下搅拌30h。反应结束后，迅速冷却至室温终止反应，冷冻干燥。采用邻苯二甲醛方法测定所得糖基化大豆蛋白的接枝度。实施例1和对比实施例1结合物的性能对比结果如表1所示：表1从表1可以看出，本专利技术实施例1中以葡聚糖既作为拥挤试剂又作为反应多糖所得糖基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法，其特征在于，包括以下步骤：　　（１）在拥挤试剂中加入缓冲溶液，搅拌，得到溶液；　　（２）将蛋白和葡聚糖加入步骤（１）得到的溶液中，搅拌２ｈ后，加入ＮａＮ↓［３］，在５℃放置２４ｈ，再在５０～７０℃搅拌１２～４８ｈ后，迅速冷却至低于２５℃，得到糖基化蛋白产物；　　所述拥挤试剂的质量份数为１０～４０份，　　蛋白的质量份数为１～１０份，　　蛋白与多糖的质量比为１∶３～１∶６。

【技术特征摘要】
1.一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在拥挤试剂中加入缓冲溶液，搅拌，得到溶液；(2)将蛋白和葡聚糖加入步骤(1)得到的溶液中，搅拌2h后，加入NaN3，在5℃放置24h，再在50～70℃搅拌12～48h后，迅速冷却至低于25℃，得到糖基化蛋白产物；所述拥挤试剂的质量份数为10～40份，蛋白的质量份数为1～10份，蛋白与多糖的质量比为1∶3～1∶6。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白为大豆酸沉蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麦面筋蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拥挤试剂为高分子惰性聚合物或多糖。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液是pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐军茹，杨晓泉，卓秀英，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]