本发明专利技术涉及一种可多聚化的CAR分子及其构建方法和其应用，所述可多聚化的CAR分子由scFv、FKBP结构域、CD8α铰链区和跨膜区、4‑1BB共刺激结构区域、CD3胞内信号区域组成。本发明专利技术的可多聚化的CAR分子形成的聚合物通过提高对免疫受体酪氨酸激活基序(I TAMs)的磷酸化、形成稳定有序免疫突触，可以更快诱发激活信号、脱颗粒效应，实现更好的抗肿瘤作用且安全有效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及可多聚化的car分子及其构建方法和其在增效car t细胞抗瘤效能中的应用。
技术介绍
1、恶性肿瘤为全球发病率和死亡率最高的疾病之一。流行病学数据显示，我国恶性肿瘤发病率占全球23％、死亡率占30％。我国肿瘤防治形势严峻，开发新的肿瘤治疗手段势在必行。近年来，以嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)疗法为代表的免疫治疗取得了巨大成功，并成为肿瘤精准治疗领域的研究热点。但cart细胞的自身不足极大地限制了cart治疗的长期获益，包括cart细胞对抗原低表达的肿瘤细胞识别和杀伤能力不足、cart细胞发生耗竭而难以在体内长期维持等。有关cart细胞的改进研究主要聚焦在胞内信号域，对car分子膜外结构的优化还缺乏系统性研究。因此，开发更优异的cart细胞药物具有迫切的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种可多聚化的car分子，所述可多聚化的car分子由单链抗体scfv、fkbp结构域(fk506结合蛋白，简称fkbp)、cd8α铰链区和跨膜区、4-1bb共刺激结构区域、cd3胞内信号区域组成。
2、本专利技术优选技术方案中，在car分子的胞外结构域中设置fkbp结构域。
3、本专利技术的优选技术方案中，所述fkbp结构域的氨基酸序列如seq id no:1所示，或包含与seq id no：1所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的氨基酸序列。
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p>4、本专利技术的优选技术方案中，所述fkbp结构域的核苷酸序列如seq id no:2所示，或包含与seq id no：2所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的核苷酸序列。5、本专利技术的优选技术方案中，所述fkbp的蛋白数量为1个或多个，优选为1-5个，更优选为2-4个。
6、本专利技术的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子胞外段设置有1-5个fkbp的蛋白，优选为2-3个。
7、本专利技术的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子胞外段有两个串联的fkbp的蛋白。
8、本专利技术的优选技术方案中，所述fkbp的蛋白之间由连接肽连接，所述连接肽包括但不限于二硫键、柔性连接肽。
9、本专利技术的优选技术方案中，所述柔性连接肽为(ggggs)n，n＝2-5个。
10、本专利技术的优选技术方案中，所述柔性连接肽的氨基酸序列如seq id no:3所示，核苷酸序列如seq id no:4所示。
11、本专利技术的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子通过诱导剂诱导后，car分子的fkbp的蛋白发生聚合，形成二聚体或多聚体。
12、本专利技术的优选技术方案中，所述诱导剂为ap1903。
13、本专利技术的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子靶向的抗原可选自cd16、cd64、cd78、cd96、cll1、cd116、cd117、cd71、cd45、cd71、cd123、cd138、erbb2(her2/neu)、癌胚抗原(cea)、上皮细胞粘附分子(epcam)、表皮生长因子受体(egfr)、egfr变体iii(egfrviii)、cd19、cd20、cd30、cd40、cd43、双唾液酸神经节苷脂gd2、导管上皮粘蛋白、gp36、tag-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(afp)、外源凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、muthsp70-2、mcsf、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、laga-1a、p53、prostein、psma、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白b2、cd22、胰岛素生长因子(igf1)-i、igf-ii、igfi受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(mhc)分子、5t4、ror1、nkp30、nkg2d、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域a(eda)和额外结构域b(edb)、腱生蛋白-c的a1结构域(tnca1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、cd3、cd4、cd8、cd24、cd25、cd33、cd34、cd133、cd138、foxp3、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、gm-csf、细胞因子受体、内皮因子、bcma(cd269、tnfrsf17)、tnfrsf17(uniprotq02223)、slamf7(uniprotq9nq25)、gprc5d(uniprotq9nzd1)、fkbp11(uniprotq9nyl4)、kamp3、itga8(uniprotp53708)、fcrl5(uniprotq68sn8)和her2的任一种或其组合。
14、在其中一些实施方式，所述可多聚化的car分子靶向的抗原为cd19和cd20，其中cd19的scfv序列可参考专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1，非专利文献(sabrina k,qi z,michael s,fran,ois-loic c,els v,buchholz cj.cd19 andcd20 targeted vectors induce minimal activation of resting b lymphocytes.plosone 2013,8(11):e79047；或ruella m,barrett dm,kenderian ss,shestova o,hofmanntj,perazzelli j,et al.dual cd19 and cd123 targeting prevents antigen-lossrelapses after cd19-directed immunotherapies.j clin invest 2016,126(10):3814-3826.或turtle cj,hanafi la,berger c,gooley ta,cherian s,hudecek m,etal.cd19car-t cells of defined cd4+:cd8+composition in adult b cell allpatients.j clin invest 2016,126(6):2123-2138.或gust j,hay ka,hanafi la,li d,myerson d,gonzalez-cuyar lf,et al.endothelial activation and blood-brainbarrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with cd19本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种可多聚化的CAR分子，所述可多聚化的CAR分子由scFv、FKBP结构域、CD8α铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激结构区域、CD3胞内信号区域组成，优选地，在CAR分子的胞外结构域中设置FKBP结构域。
2.如权利要求1所述的CAR分子，所述可多聚化的CAR分子由scFv、FKBP结构域、CD8α铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激结构区域、CD3胞内信号区域组成，所述FKBP的蛋白数量为1个或多个，优选为1-5个，更优选为2-4个。
3.如权利要求1-2任一项所述的CAR分子，所述FKBP结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或包含与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的CAR分子，所述FKBP结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或包含与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的核苷酸序列。
>5.如权利要求1-4任一项所述的CAR分子，所述可多聚化的CAR分子通过诱导剂诱导后，CAR分子的FKBP的蛋白发生聚合，形成二聚体或多聚体，优选地，所述诱导剂为AP1903。6.如权利要求1-5任一项所述的CAR分子，所述可多聚化的CAR分子靶向的抗原可选自CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、CD43、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、MCSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROTQ9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)、FCRL5(UNIPROTQ68SN8)和HER2的任一种或其组合。
7.一种可多聚化的CAR T细胞的构建方法，即在CAR分子的胞外结构域中设置FKBP结构域，优选地，可多聚化的CAR分子由scFv、FKBP结构域、CD8α铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激结构区域、CD3胞内信号区域组成。
8.一种T细胞，其表达如权利要求1-6任一项所述的可多聚化的CAR分子或如权利要求7所述的构建方法构建得到的可多聚化的CAR分子。
9.一种试剂盒，包括如权利要求1-6任一项所述的可多聚化的CAR分子或如权利要求7所述的构建方法构建得到的可多聚化的CAR分子，还包括诱导剂。
10.如权利要求1-6任一项所述的可多聚化的CAR分子或如权利要求7所述的构建方法构建得到的可多聚化的CAR分子在杀伤肿瘤细胞中的应用，或用于制备抗肿瘤药物中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种可多聚化的car分子，所述可多聚化的car分子由scfv、fkbp结构域、cd8α铰链区和跨膜区、4-1bb共刺激结构区域、cd3胞内信号区域组成，优选地，在car分子的胞外结构域中设置fkbp结构域。
2.如权利要求1所述的car分子，所述可多聚化的car分子由scfv、fkbp结构域、cd8α铰链区和跨膜区、4-1bb共刺激结构区域、cd3胞内信号区域组成，所述fkbp的蛋白数量为1个或多个，优选为1-5个，更优选为2-4个。
3.如权利要求1-2任一项所述的car分子，所述fkbp结构域的氨基酸序列如seq id no:1所示，或包含与seq id no：1所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的car分子，所述fkbp结构域的核苷酸序列如seq id no:2所示，或包含与seq id no：2所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的核苷酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的car分子，所述可多聚化的car分子通过诱导剂诱导后，car分子的fkbp的蛋白发生聚合，形成二聚体或多聚体，优选地，所述诱导剂为ap1903。
6.如权利要求1-5任一项所述的car分子，所述可多聚化的car分子靶向的抗原可选自cd16、cd64、cd78、cd96、cll1、cd116、cd117、cd71、cd45、cd71、cd123、cd138、erbb2(her2/neu)、癌胚抗原(cea)、上皮细胞粘附分子(epcam)、表皮生长因子受体(egfr)、egfr变体iii(egfrviii)、cd19、cd20、cd30、cd40、cd43、双唾液酸神经节苷脂gd2、导管上皮粘蛋白、gp36、tag-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(afp)、外源凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-ca ix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯...
【专利技术属性】
技术研发人员：王歈，魏建树，孙磊，
申请(专利权)人：北京永泰瑞科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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