【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，尤其涉及一种用于贴壁/悬浮生长细胞的细胞蜡块切片制作方法，以及它们在生化染色、分子检测中的应用。
技术介绍
1、体外培养的细胞，按照其生长方式大体可分为贴附型细胞(贴壁细胞)和悬浮型细胞(悬浮细胞)两大类。
2、贴壁细胞(adherent cell)：细胞生长必须贴附于支持物表面，依靠其自身分泌的或培养基中提供的黏附因子才能在支持物表面生长和繁殖。悬浮细胞(suspension cell)：细胞生长不依赖支持物表面，在培养基中呈悬浮状态生长。此外，还有一类细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，还可以在培养基中呈悬浮状态生长，这类细胞称之为兼性贴壁细胞。
3、苏木精-伊红染色(he染色)是一种常用的染色技术。这种染色方法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。he染色法主要是通过苏木精和伊红两种染料对细胞核和胞质进行染色，使细胞核内的染色质和胞质内的核酸着紫蓝色，而细胞质和细胞外基质中的成分则着红色。
4、免疫细胞化学染色(icc染色)和免疫荧光染色(if染色)属于免疫细胞化学技术，用于检测细胞中的特定蛋白质。二者原理均是利用抗体与抗原之间的相互作用来定位和监测抗原表达。
5、he染色、icc染色和if染色是体外组织和细胞实验中常用到的实验方法。然而针对于体外培养的细胞(无论是贴壁细胞或是悬浮细胞)，he染色、icc染色和if染色通常需要借助于细胞爬片的制备，进行后续的染色。
6、细
7、此外，悬浮细胞进行he染色、icc染色和if染色时存在技术挑战。由于悬浮细胞的黏附性差，通常采用特殊处理(如明胶或多聚赖氨酸包被)，但细胞爬片效果欠佳。或是将收集的悬浮细胞涂抹于明胶或多聚赖氨酸包被的载玻片上，潮干固定后进行后续染色，但细胞常常会由于机械性挤压变形。此外，细胞爬片方法成本较高。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、为了解现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种细胞蜡块切片的制备方法，以及细胞蜡块切片在体外细胞实验中的应用。细胞蜡块制备后可长期保存，常温下可保存超过30年，并且能够多次切片。同时制备好的细胞蜡块不仅可用于he染色、icc染色或if染色，同样适用于二代基因测序等分子检测实验。此外，制备好的细胞蜡块体积较小，切片后可将多个细胞块的切片捞片于一张载玻片上，同时进行染色，充分节约成本和耗材。
2、对此，本专利技术采用以下技术方案：
3、在一方面，本专利技术提供一种用于细胞切片的细胞蜡块制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4、(1)细胞收集；
5、(2)细胞重悬、固定；
6、(3)固定后的细胞收集；
7、(4)再固定、脱水、透明、浸蜡及包埋；
8、(5)保存细胞蜡块，或将蜡块用于后续实验。
9、具体地，步骤(1)中，所述细胞为贴壁细胞，所述细胞收集方法为：
10、细胞培养至密度达到80％，吸弃培养基，用适量预冷的pbs洗涤细胞1次，加入适量0.25％胰蛋白酶-edta消化液处理细胞，制备为细胞悬液，细胞悬液400rpm，离心5min，收集细胞沉淀①，用适量预冷的pbs洗涤细胞沉淀①1-2次，收集洗涤后的细胞沉淀②。
11、具体地，步骤(1)中，所述细胞为悬浮细胞，所述细胞收集方法为：
12、细胞培养至密度达到80％，收集细胞悬液，细胞悬液400rpm，离心5min，收集细胞沉淀①，用适量预冷的pbs洗涤细胞沉淀①1-2次，收集洗涤后的细胞沉淀②。
13、更具体地，所述pbs洗涤细胞沉淀①的方法为：
14、向细胞沉淀①中加入适量预冷的pbs，重悬细胞，400rpm，离心5min，收集细胞沉淀，得到细胞沉淀②。
15、具体地，步骤(2)中，所述细胞重悬的方法为：
16、向细胞沉淀②中加入适量固定剂a，轻柔并充分吹打，避免细胞聚集或聚团，重悬细胞；所述固定的方法为：重悬后的细胞在-20℃下过夜，使细胞自然沉降并充分固定。
17、具体地，步骤(3)中，所述固定后的细胞收集方法为：
18、将固定后的细胞转移至离心管内，收集细胞沉淀③，将细胞沉淀③转移至滤纸上，滴加适量伊红染液使细胞沉淀③染色，制得细胞沉淀④，再将细胞沉淀④转移至包埋盒中；
19、所述收集细胞沉淀③的方法为：
20、自然沉降；或400rpm，离心1min。
21、具体地，步骤(4)中，所述再固定、脱水、透明、浸蜡及包埋方法为：
22、1)再固定：向细胞沉淀④中加入适量固定剂b，4℃下过夜，使细胞沉淀④充分固定，得到再固定细胞团块；
23、2)脱水：再固定细胞团块经过50％脱水剂脱水4h、70％脱水剂脱水2h、80％脱水剂脱水2h、95％脱水剂脱水1h和无水脱水剂脱水1h梯度脱水，每次脱水在摇床上缓慢摇晃进行，得到脱水细胞团块；
24、3)透明：将脱水细胞团块用透明剂透明3次，每次透明15min，得到透明细胞团块；
25、4)浸蜡：将透明细胞团块用包埋剂在54-65℃下浸泡3次，每次浸泡1小时，得到浸蜡细胞团块；
26、5)包埋：将浸蜡细胞团块从最后1次浸泡的包埋剂中取出，置入充满熔融包埋剂的包埋框内，包埋成块，使浸蜡细胞团块和包埋剂相熔一体并迅速冷却，得到细胞蜡块。
27、在另一方面，本专利技术提供一种用于贴壁细胞的细胞蜡块切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
28、(1)细胞收集：细胞培养至密度达到80％，吸弃培养基，用适量预冷的pbs洗涤细胞1次，加入适量0.25％胰蛋白酶-edta消化液处理细胞，制备为细胞悬液，细胞悬液400rpm，离心5min，收集细胞沉淀①，向细胞沉淀①中加入适量预冷的pbs，重悬细胞，400rpm，离心5min，收集细胞沉淀，重复1-2次，收集洗涤后的细胞沉淀②；
29、(2)细胞重悬、固定：向细胞沉淀②中加入适量固定剂a，轻柔并充分吹打，避免细胞聚集或聚团，重悬细胞；所述固定的方法为：重悬后的细胞在-20℃下过夜，使细胞自然沉降并充分固定；
30、(3)固定后的细胞收集：将固定后的细胞转移至离心管内，采用自然沉降或400rpm，离心1min的方式收集细胞沉淀③，将细胞沉淀③转移至滤纸上，滴加适量伊红染液使细胞沉淀③染色，制得细胞沉淀④，再将细胞沉淀④转移至包埋盒中；
31、(4)再固定、脱水、透明、浸蜡及包埋：
32、1)再固定：向细胞沉淀④中加入适量固定剂b，4℃下过夜，使细胞沉淀④充分固定，得本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于细胞切片的细胞蜡块制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞为贴壁细胞，所述细胞收集方法为：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞为悬浮细胞，所述细胞收集方法为：
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述PBS洗涤细胞沉淀①的方法为：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞重悬的方法为：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述固定后的细胞收集方法为：
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述再固定、脱水、透明、浸蜡及包埋方法为：
8.一种用于贴壁细胞的细胞蜡块切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.一种用于悬浮细胞的细胞蜡块切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种用于细胞切片的细胞蜡块制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞为贴壁细胞，所述细胞收集方法为：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞为悬浮细胞，所述细胞收集方法为：
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述pbs洗涤细胞沉淀①的方法为：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐红，杨昌伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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