【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p30 蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是一种对家猪和欧亚野猪具有极高致死性和传染性的病毒性疫病，给世界生猪养殖业造成了巨大经济损失，被世界动物卫生组织(oie)列入须通报动物疫病名录。非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，safv)是引起asf 的病原体。asfv是一种二十面体的大型包膜病毒，双链dna基因组长度为170～190kb，基因组含有160～175个开放阅读框(orf)，编码150～200种蛋白质。这些编码蛋白中的主要结构蛋白包括：a238l 蛋白、cd2v蛋白、多基因家族蛋白、p54蛋白、p72蛋白和p32蛋白。其中，p32蛋白由cp204l基因编码，也被称为p30蛋白。该蛋白在病毒进入宿主细胞过程中起重要作用，有良好的抗原性，可在感染早期表达盒分泌，常被用于感染后免疫反应的早期检测，是一种理想的血清学诊断和免疫学检测抗原。
2、p30蛋白包含优势抗原决定簇，具有良好的抗原性，可以诱导机体产生较强的体液免疫效应。由此可见，基于p30蛋白的研究意义重大。然而，作为asfv主要结构蛋白和重要抗原蛋白，p30分子结构仍未被解析。
3、因此，其单克隆抗体的制备，可为asfv检测及其p30蛋白的结构解析提供重要工具。
4、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目
2、本专利技术的第二目的在于提供上述试剂盒的制备方法。
3、为了实现上述目的，本专利技术特采用如下方案：
4、一种非洲猪瘟病毒p30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括抗体检测芯片和酶标试剂，其中，所述抗体检测芯片设有点样点，该点样点包括包被有p30蛋白的检测点；所述酶标试剂含有酶标记的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体4c12。
5、本专利技术的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体4c12含有重链可变区和轻链可变区，重链可变区为seq.id no.1所示的氨基酸序列；轻链可变区为seq.id no.2所示的氨基酸序列。
6、单克隆抗体4c12重链可变区氨基酸序列为:
7、evmlvesggglvkpggslklscaasgftftnyamswv rqtpekrlewvatigsggsytyypdsvkgrftisrdnakntlylq msslrsedtamffcarphyqfyfdywgqgttltvss(seq.id no.1)。
8、单克隆抗体4c12轻链可变区氨基酸序列为:
9、divltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhw nqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeed aatyycqhirepytfgggtkleik(seq.id no.2)。
10、上述试剂盒以非洲猪瘟病毒p30蛋白作为抗原，利用待测样本中抗体与酶标记的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体4c12竞争结合抗原，通过竞争法检测抗体。非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体 4c12识别的抗原表位位于非洲猪瘟病毒p30蛋白，对非洲猪瘟病毒p30的抗体阻断率90％以上，与非洲猪瘟病毒反应呈阳性，可高效价地用于多个组织的免疫组化检测，表明其与非洲猪瘟病毒具有良好的反应特性。
11、进一步地，本专利技术中抗体检测芯片的点样点还包括包被有羊抗鼠igg的质控点。
12、传统elisa试剂盒均设有阴性对照、阳性对照或标准品作为试剂盒内的质控品，与之相比，本专利技术提供的试剂盒，在反应载体上设有质控点，该质控点包被有商品化羊抗鼠igg，不需要再在试剂盒中设有阴性对照、阳性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等，还降低了人力、动物试验场地的成本，同时大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。而羊抗鼠igg可以商业上购买或通过常规方法制备，操作简便。
13、在优选的实施方式中，羊抗鼠igg的包被量为5ng/点。当质控点的羊抗鼠igg的包被量为5ng/点时，阴性血清的质控点灰度值与检测点灰度值较为接近，检测结果更准确。优选地，质控点数量为 3个。
14、在优选的实施方式中，p30蛋白的包被量为1～32ng/点，优选为4～16ng/点，进一步优选为8ng/点。实验证明，当p30蛋白的包被量为1～32ng/点时n/p值为11.50～13.60均可满足检测，但当包被量为4～16ng/点时n/p值略优(为13.11～13.60)，包被量为8ng/点时n/p 值为较优(为13.60)，其中，n/p为阴性猪血清(n)与阳性血清(p)的比值。
15、进一步地，本专利技术抗体检测芯片的点样点还包括包被有点样液的空白对照点。
16、优选地，所述点样液为体积比10∶15∶0.1∶50∶100的5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、dmso溶液、pbs(ph6.8) 溶液。
17、进一步地，作为标记酶的种类包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-d-半乳糖苷酶。
18、在优选的实施方式中，酶标试剂的缓冲液为含有体积比 20％胎牛血清的pbs溶液。
19、在优选的实施方式中，酶标记的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体4c12的浓度为50ng/ml。
20、进一步地，本专利技术试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液和底物液。
21、在优选的实施方式中，洗涤液为含1％v/v吐温20的pbs 溶液。
22、在优选的实施方式中，样品稀释液为含10％v/v胎牛血清、 0.05％～0.2％v/vtriton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液。
23、在优选的实施方式中，底物液为tmb溶液。
24、进一步地，本专利技术的抗体检测芯片设置于底端和上格栅之间，共同组成检测芯片亚单元，上格栅设有检测孔，待测样品通过检测孔与点样点接触。
25、在优选的实施方式中，所述试剂盒包括至少一个所述检测芯片亚单元。
26、进一步地，点样点(例如检测点、质控点和空白对照点) 之间的边缘距离至少为700μm，点样点到检测芯片亚单元上边缘或下边缘的距离至少为8mm，点样点到检测芯片亚单元左边缘或右边缘的距离至少为5mm。
27、在优选的实施方式中，点样点具体设置如图1的a-e所示，质控点(1)、质控点(2)、质控点(3)的羊抗鼠igg包被量均为5ng/ 点、空白对照点(4)为点样液，非洲猪瘟病毒p30蛋白点样于检测点 (5)；质控点(1)、质控点(2)、质控点(3)、空白对照点(4) 这四种点样点分别位于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角，检测点(5)可以位于所述抗体检测芯片其他位置。...
【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗体检测芯片和酶标试剂；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述点样点还包括包被有羊抗鼠IgG的质控点；
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述P30蛋白的包被量为1～32ng/点，优选为4～16ng/点，进一步优选为8ng/点。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述点样点还包括包被有点样液的空白对照点；
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶；
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液和底物液；
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体检测芯片设置于底端和上格栅之间组成检测芯片亚单元，所述上格栅设有检测孔，待测样品通过检测孔与点样点接触；
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，点样点之间的边缘距离至少为700μm，点样点到检测芯片亚单元上边缘或下边缘的距离至少为8m
9.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，将P30蛋白点样于膜上，制备抗体检测芯片，酶标记非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12得到酶标试剂，得到所述试剂盒。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒p30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗体检测芯片和酶标试剂；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述点样点还包括包被有羊抗鼠igg的质控点；
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述p30蛋白的包被量为1～32ng/点，优选为4～16ng/点，进一步优选为8ng/点。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述点样点还包括包被有点样液的空白对照点；
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-d-半乳糖苷酶；
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀...
【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，潘姣姣，张许科，
申请(专利权)人：洛阳中科生物芯片技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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