【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于材料，具体涉及一种噬菌体介导靶向光敏剂及其制备方法和应用。
技术介绍
1、抗生素是临床细菌感染治疗中常见的使用药物，然而即使是窄谱的抗生素也可能会对人体正常微生物或细胞造成损伤，从而诱发其他疾病如肠胃炎、过敏等。除此之外，抗生素滥用导致的耐药菌进化危机也难以避免。
2、噬菌体是以细菌为宿主的细菌病毒，其与细菌的结合具有严格的特异靶向性，因此噬菌体不会对非靶向微生物或细胞造成影响。利用噬菌体所实现的噬菌体抗菌疗法与抗生素疗法相比具有不易损伤有益微生物或正常细胞、不易诱导细菌耐药性产生等优点。
3、现今，研究人员开发出了新型噬菌体靶向抗菌，将噬菌体疗法与光敏剂疗法相结合，光疗因其侵袭小、不易产生耐药等优点而被认为是最有前途的微生物感染治疗策略之一，比如：刘家宝.光敏剂的热增强细菌渗透及抗菌应用[d].东南大学.2022.doi:10.27014/d.cnki.gdnau.2022.000805。然而目前已开发出的新型噬菌体靶向抗菌剂多为利用基因工程基因编辑手段，以获得效果更显著的靶向噬菌体。该方法实验步骤相对复杂，进程缓慢，且所使用的光敏剂与噬菌体价格昂贵，若应用于实际生产中存在成本高昂的问题。
4、鉴于此，本专利技术研究团队认为有必要开发一种制备方便快捷、成本较低的具有高杀菌效力、可控的噬菌体靶向抗菌剂，为噬菌体靶向抗菌剂在临床上能够成功应用提供一种新方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决现有噬菌体靶向抗菌剂利用基因工程基
2、本专利技术的构思：
3、为此，本专利技术研究团队对于噬菌体和光敏分子进行了深入地研究，噬菌体(bacteriophage，phage)作为一种细菌病毒，由头部蛋白质外壳包裹内部的遗传物质组成，大部分噬菌体还有尾部，尾部为噬菌体提供特异性识别细菌的功能。因此，根据噬菌体特有的结构和功能，本专利技术研究团队拟对噬菌体进行改良，通过查询噬菌体头部外壳蛋白氨基酸序列，利用噬菌体头部外壳蛋白上氨基酸侧链中含量最丰富的羧基功能基团和光敏分子上的氨基官能团发生酰胺反应形成化学键，以此将光敏分子偶联在噬菌体的头部外壳蛋白上，将光敏分子的光动力功能与之进行结合，构建噬菌体抗菌偶联物(phage-antimicrobial conjugates，pacs)。噬菌体靶向到相应的细菌处，光敏分子在被最大吸收波长的光波照射激发后，会在被激发到三重态后与周围底物(如蛋白质、磷脂)或氧气反应生成活性氧(reactive oxygen species,ros)，ros会对细胞膜和dna造成损伤以破坏细菌或细胞结构，通过这种途径来治疗细菌感染。
4、基于上述专利技术构思，为了实现专利技术目的，本专利技术提供如下解决方案：
5、一种噬菌体介导靶向光敏剂，其特殊之处在于：噬菌体头部的外壳蛋白上通过酰胺反应偶联有光敏分子；所述噬菌体为头部外壳蛋白含有羧基基团的噬菌体；所述光敏分子为含有氨基基团的光敏分子；通过两者的偶联生成所需噬菌体介导靶向光敏剂。上述噬菌体介导靶向光敏剂即一种噬菌体疗法和光动力疗法协同抗菌兼具靶向功能的噬菌体抗菌偶联物(phage-antimicrobial conjugates，pacs)，其由三部分组成——噬菌体、光敏分子以及将两者连接的连接臂(即化学键)。
6、进一步地，所述噬菌体为靶向大肠杆菌escherichia coli(e.coli)atcc 11303的t4噬菌体，当然也可选用t1或t7；所述光敏分子为氨基化的rose bengal。本专利技术之所以选用靶向大肠杆菌escherichia coli(e.coli)atcc 11303的t4噬菌体，是通过nationalcenter for biotechnology information对t4噬菌体主要头部蛋白和尾丝蛋白的氨基酸序列进行调研，结果显示，在t4噬菌体的蛋白质中，羧基和氨基的含量远高于其他基团如巯基和酚羟基，其头部外壳蛋白(主要是gp23、gp22等蛋白)上羧基的含量高于氨基，而尾丝蛋白(主要是gp34、gp36、gp37等蛋白)的羧基含量低于氨基。因此，为保证有更多的分子结合到噬菌体上且尽量避免影响尾部特异性识别功能，选择了在头部蛋白上较多的羧基作为结合位点，使光敏分子和t4噬菌体上发生反应，将光敏分子偶联到t4噬菌体的蛋白质上。考虑到本专利技术光敏剂后续的应用，不仅需要能够展现出良好的抗菌性能，还需要具有一定的生物安全性能，因此在光敏剂的选择上也进行了重点选择，本专利技术选择rose bengal(rb)作为光敏分子，一方面，孟加拉红(rb)作为一种阴离子水溶性黄蒽染料，不仅可作为食品着色剂，还能够在用绿光照射时将氧分子光催化转化为单线态氧，相较于其他光敏剂，它已被用作癌症化疗的光动力敏化剂(被food and drug administration批准作为某些癌症的孤儿药)以及局部眼科诊断，可见rb具有更小的副作用，具有一定的安全性；另一方面，rb具有较高的量子产率(φ＝0.76)，最大吸收光波长在548nm左右，在光照后通过ⅱ型反应产生对细菌更具破坏力的单线态氧1o2；因此，rb作为一种较为理想的光敏分子，被选择为本专利技术中pacs的协同抗菌成分。另外，rb的分子结构中有一个具有反应活性的羧基，而在前述内容中明确了需要利用t4噬菌体蛋白质上的羧基作为偶联位点，羧基与羧基之间无法反应，意味着rb无法直接被利用于本专利技术设计的pacs中，因此，需对pb进行改性(氨基化改性)，使其能够与t4噬菌体偶联。
7、上述噬菌体介导靶向光敏剂的制备方法，其特殊之处在于，步骤如下：
8、取已知效价的噬菌体溶液，将噬菌体溶液的ph调节至6.5-7.5(该ph范围内，噬菌体的稳定性最好，即活性和效价最稳定)，并使用催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)进行活化，之后根据噬菌体溶液效价，加入适量光敏分子的二甲基亚砜溶液(即带有氨基基团的光敏分子的二甲基亚砜溶液)，混合均匀后，在低温摇床4～37℃下进行反应，反应结束后，透析得到噬菌体介导靶向光敏剂。
9、进一步地，所述噬菌体溶液选用t4噬菌体溶液；
10、所述光敏分子选用氨基化的rose bengal；其中，rose bengal的氨基化过程具体如下：
11、将rose bengal和溴乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf，该反应溶剂溶解性、稳定性好，不会和原料发生反应)中，加热反应，待反应结束，减压蒸馏除去n,n-二甲基甲酰胺，并依次在无水乙醚和水中多次洗涤(以去除反应残留或产生的副产物如光敏分子或hbr等)，过滤后在甲醇中重结晶，在真空中除去残余甲醇，得到改性后的光敏分子rb-nh2；如若选用自身带有氨基基团的光敏分子，则不需本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种噬菌体介导靶向光敏剂，其特征在于：噬菌体头部的外壳蛋白上偶联有光敏分子；
2.根据权利要求1所述噬菌体介导靶向光敏剂，其特征在于：
3.权利要求1或2任一所述噬菌体介导靶向光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
7.权利要求1或2所述噬菌体介导靶向光敏剂在制备治疗细菌感染的抗菌剂中或者在制备杀灭细菌的光动力制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：
9.一种抗菌剂，其特征在于：其有效成分为权利要求1或2所述噬菌体介导靶向光敏剂。
10.一种光动力制剂，其特征在于：其有效成分为权利要求1或2所述噬菌体介导靶向光敏剂。
【技术特征摘要】
1.一种噬菌体介导靶向光敏剂，其特征在于：噬菌体头部的外壳蛋白上偶联有光敏分子；
2.根据权利要求1所述噬菌体介导靶向光敏剂，其特征在于：
3.权利要求1或2任一所述噬菌体介导靶向光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：
6.根据权利要求3所述...
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