【技术实现步骤摘要】
一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，属于食品分析领域。
技术介绍
1、我国畜牧业蓬勃发展，兽药使用日益广泛，不同种类的抗生素作为疾病治疗药物更加常态化和频繁化。一些养殖户为了提高经济效益不合理、大剂量联合使用多种抗生素，这导致动物源食品中多种抗生素含量超标，对食品安全构成严重威胁。残留抗生素通过食物链进入人体后，会导致机体产生多重耐药菌及潜在的dna损伤，并可能诱导细胞毒性反应，危害人类健康。因此，严格控制并检测动物源性食品中残留抗生素尤为重要。由于抗生素种类繁多，成分复杂，这为其检测方法提出了更高的要求，传统检测技术往往难以同时满足操作简单、高灵敏度、高特异性、多重检测等要求，开发新型检测技术改善现有检测方法的不足将对保障食品安全和人类健康具有重要的意义。
2、目前抗生素的检测方法已有多种，高效液相色谱法具有分辨率高、分析速度快、重现性高等优点，但前处理过程相对复杂，溶剂需要严格纯化，而且仪器设备相对昂贵。免疫学方法具有操作相对简单、快速、方法易标准化等优点，但同时敏感性相对较低，有类似于靶物质结构的干扰物质存在时，可能出现假阳性现象，测定结果依赖于所用抗体，准确性差。
3、在各种检测技术中，比色生物传感检测方法因为简单、便捷、快速、高效脱颖而出，其对分析仪器的依赖性较小，无需复杂的操作步骤，在现场分析和即时诊断方面具有较大的潜力。随着社会的发展，各种纳米材料开发为比色生物传感器的进一步发展提供了机遇，这将为其在致病病原体、化学品、重金属、食品等领域的检测注入新的血液，对于食品安全、环境卫生及生
技术实现思路
1、针对当前检测技术的不足，本专利技术的目的在于通过构建一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，实现动物源食品中抗生素残留的灵敏检测。
2、本专利技术的技术方案为：
3、一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，包括以下步骤：
4、(1)聚多巴胺纳米载银颗粒的制备
5、取2mg聚多巴胺纳米颗粒超声分散于5ml h2o中，加入1ml 0.278g/ml的柠檬酸钠溶液和新鲜配制的20ml 0.025m的硝酸银溶液，室温下搅拌3h，随后10000rpm离心10min并用超纯水洗涤3次，获得表面负载大量银的聚多巴胺银纳米颗粒。
6、(2)3通道显色纳米颗粒的制备
7、将20μl 10μm 3种不同的信号探针分别加入到1.0ml 2mg/ml的聚多巴胺银纳米颗粒溶液中，37℃振荡孵育12h后，用超纯水离心洗涤三遍，重悬于1ml水中，以获得表面连接不同信号探针的聚多巴胺银溶液。向3种聚多巴胺银/信号探针溶液中分别加入400μl溶于无水乙醇的4mm的酚酞溶液、5mm的百里香酚酞溶液、6mm姜黄素溶液以用于后续土霉素、卡那霉素、链霉素的检测，37℃振荡孵育2h后，10000rpm离心10min并用超纯水洗涤3次后，重悬到1ml水中，获得吸附大量指示剂的显色纳米颗粒。
8、上述土霉素信号探针、卡那霉素信号探针、链霉素信号探针序列分别为：
9、土霉素信号探针：5’-nh2-aaaaaacgacgcacagtcgctggtgcg-3’；
10、卡那霉素信号探针：5’-nh2-aaaaaaagatgggggttgaggctaagc-3’；
11、链霉素信号探针：5’-nh2-ggggtctgttctgctgctttgttctgtcgggtcgtctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’。
12、(3)3种磁性复合物的制备
13、取10μl磁珠用tris-hcl缓冲液洗涤3遍后重悬于5倍体积的10mm kh2po4缓冲液中备用，分别将各通道对应的20μl 4μm互补探针和20μl 4μm核酸适配体混合，95℃孵育10min缓慢冷却至室温后得杂交的双链dna，将其加入上述磁珠中，37℃孵育90min，磁性分离洗涤3次后，加入500μl 2％的牛血清白蛋白溶液对非特异性吸附位点封闭1h，得到特异性捕获目标抗生素的磁性复合物。
14、上述土霉素、卡那霉素及链霉素的互补探针和核酸适配体序列分别为：
15、土霉素适配体：5’-cgacgcacagtcgctggtgcgtacctggttgccgttgtgt-3’，
16、土霉素互补探针：5’-biotin-acacaacggcaaccaggtacgcaccagcgactgtgcgtcg-3’，
17、卡那霉素适配体：5’-ag atgggggttgaggctaagccga-3’，
18、卡那霉素互补探针：5’-biotin-atatatatattcgg cttagcctcaacccccatct-3’，
19、链霉素适配体：5’-ggggtctgttctgctgctttgttctgtcgggtcgtctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’，
20、链霉素互补探针：5’-biotin-cggcgcatgcgtcgacctgcagacgacccgacagaacaaagcagcagaacagacccc-3’。
21、(4)磁珠表面显色纳米颗粒的富集
22、向20μl磁性复合物溶液中加入20μl待测溶液和10μl kh2po4缓冲液，37℃孵育15min后，磁性分离洗涤3次，加200μl对应通道的显色纳米颗粒，37℃孵育15min，磁性分离洗涤3次。
23、(5)比色检测
24、取200μl ph 13的naoh溶液加入上述(4)中获得的溶液，使磁珠表面富集的显色纳米颗粒发生显色反应，释放出大量颜色信号，检测对应显示剂酚酞、百里香酚酞及姜黄素分别在特征波长552、594和470nm处的吸光度变化，即可对放大后的颜色信号进行获取和分析。
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1.一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于以土霉素、卡那霉素和链霉素为模型，(1)通过制备聚多巴胺载银颗粒并在其表面修饰各通道对应的显色剂和信号探针得显色纳米颗粒，(2)而后将各通道对应的适配体及互补探针杂交所得的dsDNA修饰于磁珠表面得磁性复合物，(3)当实际牛奶样品中存在任一待测物时，它会与磁性复合物表面dsDNA中的适配体结合，导致互补探针恢复单链状态后通过碱基互补配对与信号探针结合，实现显色纳米颗粒在磁珠表面的富集，(4)加NaOH后显色剂会大量释放至溶液中，各通道呈现不同颜色，利用酶标仪测定吸光度，绘制标准曲线，计算可得待测物浓度，(5)通过更换待测物所对应的适配体，可用于其他物质的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于检测方法中所述的信号探针、适配体及互补探针，序列分别为：
3.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于以土霉素、卡那霉素和链霉素为模型，通过制备聚多巴胺载银颗粒并在其表面修饰各通道对应的显色剂和信号探针得显色纳米颗粒，其步骤具体
4.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于将各通道对应的适配体及互补探针杂交所得dsDNA修饰于磁珠表面得磁性复合物，制备步骤具体是取10μL磁珠用Tris-HCl缓冲液洗涤3遍后重悬于50μL 10mM KH2PO4缓冲液中，而后分别将3种不同通道对应的20μL 4μM互补探针和20μL 4μM核酸适配体混合，95℃孵育10min缓慢冷却至室温后得杂交的双链DNA加入上述磁珠中，37℃孵育90min，磁性分离洗涤3次后，加入500μL 2％的牛血清白蛋白溶液对非特异性吸附位点封闭1h，得到可特异性捕获对应通道目标抗生素的磁性复合物。
5.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于当实际牛奶样品中存在任一待测物时，它会与磁性复合物表面dsDNA中的适配体结合，导致互补探针恢复单链状态后通过碱基互补配对与信号探针结合，实现显色纳米颗粒在磁珠表面的富集，步骤具体是向20μL磁性复合物中加入20μL待测溶液和10μL KH2PO4缓冲液，37℃孵育15min后，磁性分离洗涤3次，加入200μL对应的显色纳米颗粒，37℃孵育15min，磁性分离洗涤3次。
6.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于加200μL pH 13的NaOH溶液后，显色剂会大量释放至溶液中，各通道呈现不同颜色，利用酶标仪测定各通道对应显色剂酚酞、百里香酚酞及姜黄素在552、594和470nm处的特征波长的吸光度，绘制标准曲线，得到对应通道中不同浓度土霉素、卡那霉素及土霉素的线性检测方程，将未知浓度的样品检测得到的吸光度带入对应的线性检测方程，计算可得目标抗生素的浓度。
7.根根据权利要求1所述一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于具有通用性，只需简单通过更换待测物所对应的适配体，及其对应的互补探针、信号探针的结合序列即可实现对不同待测物质的高特异性灵敏度的分析。
...【技术特征摘要】
1.一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于以土霉素、卡那霉素和链霉素为模型，(1)通过制备聚多巴胺载银颗粒并在其表面修饰各通道对应的显色剂和信号探针得显色纳米颗粒，(2)而后将各通道对应的适配体及互补探针杂交所得的dsdna修饰于磁珠表面得磁性复合物，(3)当实际牛奶样品中存在任一待测物时，它会与磁性复合物表面dsdna中的适配体结合，导致互补探针恢复单链状态后通过碱基互补配对与信号探针结合，实现显色纳米颗粒在磁珠表面的富集，(4)加naoh后显色剂会大量释放至溶液中，各通道呈现不同颜色，利用酶标仪测定吸光度，绘制标准曲线，计算可得待测物浓度，(5)通过更换待测物所对应的适配体，可用于其他物质的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于检测方法中所述的信号探针、适配体及互补探针，序列分别为：
3.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通道比色检测方法，其特征在于以土霉素、卡那霉素和链霉素为模型，通过制备聚多巴胺载银颗粒并在其表面修饰各通道对应的显色剂和信号探针得显色纳米颗粒，其步骤具体是取2mg聚多巴胺纳米颗粒超声分散于5ml超纯水中，加入1ml 0.278g/ml柠檬酸钠溶液和20ml 0.025m新配制硝酸银溶液室温搅拌3h，10000rpm 10min离心洗涤3次后重悬于1.0ml超纯水中后，加入20μl 10μm 3种对应通道的信号探针，37℃振荡孵育12h，离心洗涤三遍后等体积重悬，再分别加入400μl 3通道对应的显示剂，即4mm的无水乙醇溶解的酚酞溶液、5mm无水乙醇溶解的百里香酚酞溶液、6mm无水乙醇溶解的姜黄素溶液，各自37℃振荡孵育2h，10000rpm 10min超纯水离心洗涤3次后，等体积重悬到1ml水中，即可获得吸附了大量显色剂的显色纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的一种通用的牛奶中抗生素的3通...
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