【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种多基因甲基化联合检测试剂及试剂盒，属于生物医药。本专利技术提供的引物探针组合包括针对人肠癌的特异性引物和探针，采用本专利技术的检测试剂或试剂盒，可以实现对人肠癌的高特异性、高灵敏度、高效率的检测。
技术介绍
1、结直肠癌，又称为大肠癌，是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国逐年升高。结直肠癌早期发病隐匿，常无明显症状，晚期可出现便血、腹痛、腹泻等症状。而当出现症状就诊时常常是晚期，这给病人带来极大的痛苦和昂贵的治疗费用。因此早发现、早诊断、早治疗是降低结直肠癌发病率和死亡率的一项重要措施。
2、筛查可以早期发现肠癌和癌前病变，并去除病灶，从而阻止肠癌的发生。粪便基因检测作为一种新的肠癌筛查方法，现在越来越受到重视。该方法于2016年纳入美国的肠癌筛查指南。该方法具有方便、无创、对肠癌和癌前病变腺瘤的检出率高等特点。要做成对肠癌检测高性能的粪便基因检测试剂盒，主要需要克服两大障碍：粪便dna的提取和标志物选择。一方面，粪便中成分复杂，对下游反应的抑制物多，还有许多细菌dna，要从这样的混合物中提取出人的目标基因，需要一套高敏的基因提取和纯化方法；另一方面，目前和肠癌相关的标志物很多，尤其是dna甲基化标志物，因为研究表明，dna甲基化是肿瘤形成的早期事件。但很多甲基化标志物在细胞、组织层面表现很好，当用于粪便、血液等筛查媒介时，其对肠癌的敏感性和特异性会显著降低。
3、另外，由于大肠癌的发病机理比较复杂，是多基因遗传疾病。需要筛选出能够互补的甲基化标志物提高检测的敏感性和特异性，目前
4、因此，挑选在粪便中对肠癌有极高检测敏感性和特异性的标志物组合是肠癌粪便基因检测的关键，并且这样的标志物组合有望真正用于肠癌的临床检测，且良好的引物和探针的设计也是影响标志物组合发挥作用的影响因素之一。
5、综上，迫切需要开发一种检测肠癌敏感性和特异性高且检测基因少的甲基化联合检测试剂。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种多基因甲基化联合检测试剂及试剂盒。本专利技术所提供的引物组可以覆盖腺病毒全部亚属，解决了现有技术中试剂盒覆盖型别少、检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
2、为了实现上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种引物组合，所述引物组合为seq id no：1和seq id no：2、seq id no：13和seq id no：14所示的引物对组合；或
3、seq id no：1和seq id no：2、seq id no：16和seq id no：17所示的引物对组合；或
4、seq id no：4和seq id no：5、seq id no：13和seq id no：14所示的引物对组合；或
5、seq id no：4和seq id no：5、seq id no：16和seq id no：17所示的引物对组合。
6、在本专利技术的第二方面，提供了一种上述引物组合的探针，所述探针为探针组合，所述探针组合为seq id no：3和seq id no：15所示的序列的组合；或
7、seq id no：3和seq id no：18所示的序列的组合；或
8、seq id no：6和seq id no：15所示的序列的组合；或
9、seq id no：6和seq id no：18所示的序列的组合。
10、在本专利技术的第三方面，提供了一种多基因甲基化联合检测试剂，所述基因为apba2(又名mint2)启动子区和col4a1/col4a2基因同源区域，包括每个基因的甲基化检测的引物；
11、所述引物为seq id no：1和seq id no：2、seq id no：13和seq id no：14所示的引物对组合；或
12、seq id no：1和seq id no：2、seq id no：16和seq id no：17所示的引物对组合；或
13、seq id no：4和seq id no：5、seq id no：13和seq id no：14所示的引物对组合；或
14、seq id no：4和seq id no：5、seq id no：16和seq id no：17所示的引物对组合。
15、进一步地，本专利技术提供的甲基化检测试剂通过检测col4a1/col4a2和apba2基因组合中的每个基因的基因体、基因间区或启动子区及启动子区附近区域的甲基化水平。
16、本专利技术中的“col4a1/col4a2”指“col4a1或col4a2”。人类基因col4a1和col4a2在13号染色体长臂的远端紧密相连，这两个基因是“头对头”的位置关系，并且是相反的转录方向。col4a1和col4a2基因的5’端靠近，之间间隔127bp，这段序列是这两个基因共用的双向启动子区。因此，根据两者共用的双向启动子设计的序列，既可以针对col4a1，也可以针对col4a2。在本专利技术中，无论以col4a1还是col4a2标注序列信息，两者并无区别。
17、进一步地，还包括每个基因的甲基化检测的探针。
18、进一步地，所述探针为seq id no：3和seq id no：15所示的序列的组合；或
19、seq id no：3和seq id no：18所示的序列的组合；或
20、seq id no：6和seq id no：15所示的序列的组合；或
21、seq id no：6和seq id no：18所示的序列的组合。
22、在本专利技术的第四方面，提供了包含上述引物组合和上述探针、或上述试剂的试剂盒。
23、进一步地，所述试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物组合；第二容器，其包含探针。
24、进一步地，本专利技术提供的试剂盒还包括试剂盒中的常用试剂，如qmsp中常用转化剂，用于将非甲基化的胞嘧啶碱基都转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。所述的转化剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或几种。又如扩增col本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对组合；或
2.一种探针，其特征在于，所述探针为探针组合，所述探针组合为SEQ ID NO：3和SEQID NO：15所示的序列的组合；或
3.一种多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述基因为APBA2和COL4A1/COL4A2，包括每个基因的甲基化检测的引物；
4.如权利要求2所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，还包括每个基因的甲基化检测的探针。
5.如权利要求4所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述探针为SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：15所示的序列的组合；或
6.包含权利要求1所述引物组合和权利要求2所述探针、或权利要求2-4任一所述试剂的试剂盒。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物组合；第二容器，其包含探针。
8.如权利要求1所述的引物组合和权利要求2所述
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述引物组合或所述试剂在同一反应孔进行检测。
...【技术特征摘要】
1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合为seq id no：1和seq id no：2、seq idno：13和seq id no：14所示的引物对组合；或
2.一种探针，其特征在于，所述探针为探针组合，所述探针组合为seq id no：3和seqid no：15所示的序列的组合；或
3.一种多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述基因为apba2和col4a1/col4a2，包括每个基因的甲基化检测的引物；
4.如权利要求2所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，还包括每个基因的甲基化检测的探针。
5.如权利要求4所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴孝林，刘伟芳，罗茵，
申请(专利权)人：广州德成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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