【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，特别涉及引物和探针组合物、试剂盒及在检测ikzf1基因缺失中的应用。
技术介绍
1、大量文献研究表明，ikzfl基因缺失在急性b淋巴细胞白血病(b-all)的发病机制中扮演重要角色，其编码的ikros蛋白是锌指转录因子之一，在淋系细胞发育中起到重要作用。60％的ph阳性all患者和约68％的ph-likeall患者中都可检测到ikzf1基因缺失。另外，这种缺失几乎不存在于cml患者中，但约86％cml患者在all急变期时可检测到发生ikzf1缺失，是cml患者急变的重要促进因素。在b-all中，该基因变异与不良预后和更高复发率相关，普遍认为ikzf1基因缺失是all的独立危险因素。
2、ikzfl基因共有8个外显子，其编码的ikros蛋白具有两个功能域：其一为邻近n端的dna结合区，由4、5、6号外显子编码出的4个锌指结构域组成，具有dna结合能力和转录活性；另一功能域为邻近c端的二聚体形成区，由8号外显子编码出的2个锌指结构域组成，参与ikros蛋白二聚体的形成。通过选择性剪接，共产生13种不同的转录异构体，相应的蛋白亚型分别为：ik1，ik2，ik2a，ik3，ik3a，ik4，ik4a，ik5，ik6，ik7，ik8，ik9和ik10(图1)，其中ik1-ik3为功能亚型，其余均为功能缺失亚型，以ik6和ik10最为常见。ik6是ikzfl基因4号外显子到7号外显子出现缺失(△4-7)，ik6亚型缺乏dna结合区，它不仅能抑制与之结合的功能亚型ikros发挥正常的生理功能，并且是ik
3、目前针对ikzf1基因缺失的检测方法并不多，主要有单核苷酸多态性阵列(snp-array)以及多重连接依赖式探针扩增技术(mlpa)。
4、snp(single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性而形成的遗传标记。snp-array技术利用待测样本与芯片探针进行单杂交，通过比较不同样本信号的强度来确定每个位点的拷贝数。snp-array是一种高通量的dna序列检测技术，能快速帮助我们检测基因拷贝数的变化。而且图谱清晰度高，目前探针密度最高的芯片，可使snp-array的分辨率达到3kb。但是这些探针在基因组中并非均衡分布，在部分复杂和重复序列的cnv区域，snp密度是较小的，这时就无法得到较为清晰的cnv图谱。而且snp-array所需仪器、试剂成本费用高昂，对操作者的要求较高，对于明确单个基因例如ikzf1基因缺失的检测没有优势，所以在临床上难以全面开展。
5、多重连接依赖式探针扩增技术(mlpa)是在dna靶序列的特定变异位点(如点突变)两侧设计一对mlpa探针。每条探针包含一段通用引物序列和一段特异性杂交序列。杂交序列与靶序列杂交后，使用连接酶将两部分探针连接成一条核苷酸单链，再使用通用引物进行pcr扩增。通过比较待测dna与正常对照dna的pcr产物量，来确定待测样本dna靶序列的拷贝数。值得注意的是，只有在检测位点处探针与靶序列完美互补配对的情况下，连接酶才能将两部分探针顺利连接成单链进行后续扩增。如果检测位点存在甲基化、点突变、cnv，则探针连接失败，不能进行后续pcr扩增，该方法操作繁琐，耗时较长、灵敏度不高，同时也不具备基因缺失拷贝数定量的能力。
6、基于以上，有必要开发一种ikzf1基因缺失引物和探针组合物、试剂盒及方法来解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出引物和探针组合物、试剂盒及在检测ikzf1基因缺失的应用，以至少解决以上现有技术存在的诸多缺陷之一。
2、鉴于此，本专利技术的方案为：
3、本专利技术的第一个方面，提供用于检测ikzf1基因缺失的引物和探针组合物，包括分别用于检测ikzf1基因的2-7号外显子的引物对和探针以及β-globin内参基因引物对和探针；所述用于检测ikzf1基因的2号外显子的引物对序列如seq id no:1-2所示，所述用于检测ikzf1基因的3号外显子的引物对序列如seq id no:4-5所示，所述用于检测ikzf1基因的4号外显子的引物对序列如seq id no:7-8所示，所述用于检测ikzf1基因的5号外显子的引物对序列如seq id no:10-11所示，所述用于检测ikzf1基因的6号外显子的引物对序列如seq id no:13-14所示，所述用于检测ikzf1基因的7号外显子的引物对序列如seq id no:16-17所示，所述用于检测ikzf1基因2-7号外显子的探针序列分别如seq id no:3、seq idno:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15、seq id no:18所示；所述用于检测β-globin内参基因的引物对序列如seq id no:19-20所示，探针序列如seq id no:21所示。
4、进一步地，所述用于检测ikzf1基因的2号和5号外显子的探针序列5'端标记fam荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团；所述用于检测ikzf1基因的3号和6号外显子的探针序列5'端标记vic荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团；所述用于检测ikzf1基因的4号和7号外显子的探针序列5'端标记rox荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团；所述β-globin内参基因探针序列5'端标记有cy5荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团。
5、本专利技术的第二个方面，提供一种试剂盒，包括以上第一个方面所述的引物和探针组合物。
6、进一步，所述试剂盒还包括阳性标准品、阴性标准品、ddpcr supermix和ddh2o。
7、进一步，所述引物对浓度均为6-9μm，探针组浓度为3-8μm。
8、本专利技术第三个方面，提出第二个方面所述试剂盒在非诊断为目的检测ikzf1基因缺失中的应用。
9、上述检测方法中，非诊断为目的的检测包括无法追溯至人的样本的检测，如某样本在实验室条件下基因缺失的检测，检测结果仅代表样本自身结果，即ikzf1基因缺失的存在或不存在。
10、本专利技术第四个方面，提出一种非诊断目的检测检测ikzf1基因缺失的方法，步骤包括：
11、s1.提取样品中基因组dna；
12、s2.将样品dna、以上第一个方面所述的引物和探针组合物以及ddpcr supermix混合，制备ddpcr混合液；
13、s3.将ddpcr混合液制成pcr微反应液滴，进行数字pcr扩增反应；
14、s4.对pcr扩增反应后的产物进行多重荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物和探针组合物，其特征在于，包括引物对及探针组，引物对包括如SEQ ID NO：1-2、SEQ ID NO：4-5、SEQ ID NO：7-8、SEQ ID NO：10-11、SEQ ID NO：13-14、SEQ ID NO：16-17、SEQ ID NO：19-20所示的核苷酸序列；探针组包括如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组中，如SEQ IDNO：3、12所示的探针序列5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；如SEQ IDNO：6、15所示的探针序列5'端标记VIC荧光报告基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；如SEQ IDNO：9、18所示的探针序列5'端标记ROX荧光报告基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；如SEQ IDNO：21所示的探针序列5'端标记有CY5荧光报告基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。
<...【技术特征摘要】
1.引物和探针组合物，其特征在于，包括引物对及探针组，引物对包括如seq id no：1-2、seq id no：4-5、seq id no：7-8、seq id no：10-11、seq id no：13-14、seq id no：16-17、seq id no：19-20所示的核苷酸序列；探针组包括如seq id no：3、seq id no：6、seq idno：9、seq id no：12、seq id no：15、seq id no：18、seq id no：21所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组中，如seq idno：3、12所示的探针序列5'端标记fam荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团；如seq idno：6、15所示的探针序列5'端标记vic荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团；如seq idno：9、18所示的探针序列5'端标记rox荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团；如seq idno：21所示的探针序列5'端标记有cy5荧光报告基团，3'端标记mgb荧光淬灭基团。
3.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物和探针组合物。
4.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮立，张加杰，张鹏，
申请(专利权)人：上海信诺佰世医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：
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