【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多肽的纯化方法，具体涉及司美格鲁肽粗肽的纯化方式，属于医药。
技术介绍
1、糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌疾病，可通过多种因素造成肾脏损伤、视网膜病变、心血管疾病等。根据发病机制的不同，糖尿病分为1型和2型糖尿病，其中2型糖尿病在糖尿病类型中占90％以上。2型糖尿病的发病机制可分为两点：胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷。大多数2型糖尿病常为胰岛素抵抗基础上出现的高血糖疾病，随着体内糖含量增加，会导致胰岛β细胞产生糖毒性，进而损伤葡萄糖氧化过程以及葡萄糖信号传导，最终使得患者胰岛素分泌出现缺陷，使得血糖持续提高。因此，目前临床治疗2型糖尿病主要采用口服降糖药或注射长效胰岛素的方法。随着人胰高血糖素-1(glp-1)及其类似物在治疗2型糖尿病的优良效果，使其在治疗糖尿病的新型药物领域占据更加重要的地位。glp-1是含有37个氨基酸残基的胃肠激素，可以与胰腺glp-1受体相结合，使其处于葡萄糖浓度依赖模式，从而有效刺激胰岛β细胞，促进胰岛素的分泌，使胰岛β细胞受损功能恢复，还能抑制胰高血糖素合成释放，最终达到降低血糖的作用。但天然的glp-1会被血浆酶二肽基肽酶iv(dpp-iv)迅速水解失活，半衰期为2min左右，因此加大了其在临床中应用的难度。所以，对glp-1的结构进行改造修饰，保留同样药理活性的同时，延长半衰期是该类新型glp-1类似物药物的研究重点。
2、目前已被fda批准用于2型糖尿病治疗的glp-1类似物有艾塞那肽注射液、利拉鲁肽注射液、司美格鲁肽注射液和司美格鲁肽片等。司美格鲁肽是由诺和诺德
3、目前，司美格鲁肽制备方法主要有两大类：一、通过生物重组法获得arg34glp-1(9-37)肽链后，再通过化学合成法添加上含有非天然氨基酸二肽和侧链；二、直接通过化学法逐步添加氨基酸合成直肽链，再添加侧链。由于在化学合成的过程中容易产生较多的杂质，如副反应杂质、同分异构体杂质、消旋杂质、氨基酸缺失或增加杂质。为了能有效去除上述杂质，司美格鲁肽粗肽的纯化大多通过反相层析法。在专利cn 110845602a中需要经过三次反相纯化和一次薄膜蒸发，才能得到纯度大于99％，最大单杂小于0.2％的司美格鲁肽样品，纯化步骤较多，其中反相纯化需要用到多种固定相，且需要新投入薄膜蒸发设备导致设备成本增加；在专利cn 105777872b中洗脱流动相中使用乙腈和异丙醇两种有机溶剂，会导致样品中有机溶剂残留风险增大，经过两步反相纯化后还需要经过一步转盐工艺得到纯度为99.38％，单一杂质小于0.15％的司美格鲁肽样品；在专利cn 111848777a中经过两步反相纯化，然后脱盐、浓缩、冻干后得到纯度大于99％的司美格鲁肽样品，未提及最大单杂水平，且脱盐采用超滤膜进行，操作时间较长，不利于工业化放大生产。
4、基于现有技术存在的问题，在保证司美格鲁肽纯度、收率、最大单杂含量的前提下，寻找到一种能降低工艺过程繁琐程度，减少周期，能够利于工业化生产的纯化方法，是亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种司美格鲁肽的纯化方法。在本专利技术中，对司美格鲁肽粗肽采用两步反相层析的纯化方式，最终经过冻干得到纯度≥99.80％，单杂≤0.06％的司美格鲁肽精肽。
2、为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种司美格鲁肽的纯化方法，通过两步反相高效液相色谱法纯化，其包括以下步骤：
4、(1)第一步纯化：以含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液和有机溶剂为流动相，以反相填料为固定相；
5、(2)第二步纯化：以含磷酸盐的碱性缓冲液和有机溶剂为流动相，以反相填料为固定相。
6、作为本专利技术的一种实施方式，所述含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液选自乙酸铵-三氟乙酸(tfa)缓冲液、乙酸钠-三氟乙酸缓冲液、乙酸钾-三氟乙酸缓冲液中的任意一种。
7、本专利技术采用乙酸盐缓冲液相对其它缓冲液(比如甲酸盐缓冲液)，缓冲能力更佳，与强酸tfa配伍使用时，能保持缓冲能力；而使用甲酸盐缓冲液与tfa配伍时，tfa会破坏体系的缓冲能力。
8、作为本专利技术的一种实施方式，所述的乙酸铵-三氟乙酸(tfa)缓冲液、乙酸钠-三氟乙酸缓冲液、乙酸钾-三氟乙酸缓冲液中tfa的质量浓度为0.001％-1％，可选0.025％-0.1％，如进一步可选为0.05％；所述的乙酸盐浓度为0.1-500mm，可选10-50mm，如进一步可选为30mm。
9、作为本专利技术的一种实施方式，所述的含乙酸盐的酸性缓冲液ph＜5.0，可选为2.0-3.0，如进一步可选为2.5；优选使用乙酸调节ph，因其不会引入新的阴离子、不会破坏体系的缓冲能力且不会影响缓冲液的浓度。
10、作为本专利技术的一种实施方式，第一步纯化使用的流动相中，以含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液和乙腈的混合溶液为流动相rp-a1，以含乙腈的水溶液为流动相rp-b，进行线性梯度洗脱，其中流动相rp-b的起始梯度为50％-60％，可选为55％；流动相rp-b的终止梯度为70％-80％，可选为75％。
11、作为本专利技术的一种实施方式，所述含磷酸盐的碱性缓冲液选自磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的任意一种。
12、作为本专利技术的一种实施方式，所述的缓冲盐浓度为0.1-500mm，可选10-50mm，如进一步可选为20mm；所述的含磷酸盐的碱性缓冲液ph＞7.0，可选为7.5-8.5，如进一步可选为8.0；优选使用磷酸调节ph，因其不会引入新的阴离子、不会破坏体系的缓冲能力且不会影响缓冲液的浓度。
13、作为本专利技术的一种实施方式，第二步纯化使用的流动相中，以含磷酸盐的碱性缓冲液和乙腈的混合溶液为流动相rp-a2，以含乙腈的水溶液为流动相rp-b，其中流动相rp-b的起始梯度为30％-40％，如可选为38％；流动相rp-b的终止梯度为41％-53％，如可选为48％。
14、作为本专利技术的一种实施方式，所述第一步纯化和第二步纯化使用的有机溶剂为含有乙腈的水溶液，如可选含有10％-60％乙腈的水溶液(质量浓度)。
15、作为本专利技术的一种实施方式，所述第一步纯化和第二步纯化使用的反相填料选自多孔二氧化硅颗粒或硅胶制成的固定相。例如，用于本申请的固定相可以由多孔二氧化硅颗粒制成，所述多孔二氧化硅颗粒具有4至18个碳原子的化学键合的直链烷基链。例如含四个(c4)、八个(c8)、十二个(c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种司美格鲁肽的纯化方法，通过两步反相高效液相色谱法纯化，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液选自乙酸铵-三氟乙酸缓冲液、乙酸钠-三氟乙酸缓冲液、乙酸钾-三氟乙酸缓冲液中任意一种。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述的三氟乙酸的质量浓度为0.001％-1％；所述的乙酸盐浓度为0.1-500mM。
4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述的含乙酸盐的酸性缓冲液pH＜5.0。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：第一步纯化使用的流动相中，以含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液和乙腈的混合溶液为流动相RP-A1，以含乙腈的水溶液为流动相RP-B，进行线性梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述含磷酸盐的碱性缓冲液选自磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于：所述的碱性缓冲液中磷酸盐的浓度为0.1-500m
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于：第二步纯化使用的流动相中，以含磷酸盐的碱性缓冲液和乙腈的混合溶液为流动相RP-A2，以含乙腈的水溶液为流动相RP-B。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述第一步纯化和第二步纯化使用的反相填料选自多孔二氧化硅颗粒或硅胶制成的固定相。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在第一步纯化之前使用含三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液和有机溶剂组成的混合溶剂溶解司美格鲁肽粗肽。
11.根据权利要求1～10任一项所述的纯化方法，其特征在于：通过粗肽预处理和两步反相高效液相色谱法纯化，其包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种司美格鲁肽的纯化方法，通过两步反相高效液相色谱法纯化，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液选自乙酸铵-三氟乙酸缓冲液、乙酸钠-三氟乙酸缓冲液、乙酸钾-三氟乙酸缓冲液中任意一种。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述的三氟乙酸的质量浓度为0.001％-1％；所述的乙酸盐浓度为0.1-500mm。
4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述的含乙酸盐的酸性缓冲液ph＜5.0。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：第一步纯化使用的流动相中，以含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液和乙腈的混合溶液为流动相rp-a1，以含乙腈的水溶液为流动相rp-b，进行线性梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述含磷酸盐的碱性缓冲液选自磷酸钠、磷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：范晓阳，吕亮，刘彬，杜慈，汤传根，
申请(专利权)人：南京汉欣医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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