一种高产４－丁内酰胺水解酶的菌株及利用该菌株制备γ－氨基丁酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用高产４－丁内酰胺水解酶的菌株ＨＨＳＷ－１６制备γ－氨基丁酸的方法，该菌株属大肠杆菌菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ?ｃｏｌｉ），命名为ＨＨＳＷ－１６，于２０１０年７月７日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．３９９８。该菌株是从黄泥田、红泥田、黄泥砂田、泥质田或黄斑田土壤中采集、培养筛选得到。利用该菌株ＨＨＳＷ－１６制备γ－氨基丁酸的反应条件温和，对底物α－吡咯烷酮的转化率达９８％以上，产物γ－氨基丁酸的收率达９０％以上，转化时间短，操作简便，产品纯度高，避免了传统方法中的腐蚀性溶剂的使用，保护了环境。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种高产4-丁内酰胺水解酶的菌株 (Escherichia coli) HHSW-16及利用该菌株制备Y-氨基丁酸的方法。该菌株为大肠埃希 氏菌菌株(Escherichia coli)，命名为HHSW-16，并于保藏日期2010年7月7日，保藏于位 于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 3998。
技术介绍
y -氨基丁酸(γ -aminobutyric acid,简称 GABA)，分子式为 C4H9NO2,相对分子量 为103. 1，白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于其他有机溶剂，是一种 天然活性成分，广泛分布于动植物体内。GABA是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动， 具有很高的生理活性。根据目前的研究，发现GABA的生理活性主要表现在以下几方面(1) GABA能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同作用，阻止与焦虑相关 的信息抵达脑指示中枢；(2)GABA能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到 降低血压的目的。(3)GABA能进入脑内三羧酸循环，促进脑细胞代谢，同时还能提高葡萄糖 代谢时葡萄糖磷酸酯酶的活性，增加乙酰胆碱的生成，扩张血管增加血流量，并降低血氨， 促进大脑的新陈代谢，恢复脑细胞功能。(4)GABA作为活性因子，具有良好的生理活性，将其 应用于功能性食品中将大有可为。虽然GABA在自然界的分布很广泛，但将其开发作为保健 食品功能因子无疑还需大量的工作。动植物组织中GABA的含量都较低，例如豆叶中的含量仅为0. 04 μ g/g鲜重，因而 从动植物体内直接提取GABA并作为食品配料的可行性不大，其原因主要是因为GABA存在 量少并且分离困难。根据目前文献报道，Y -氨基丁酸的制备方法主要有以下几种1、化学合成法GABA的化学合成已有百余年历史，主要以邻苯二甲酰亚氨钾和Y-氯丁氰在强烈 条件下(180°C)反应，产物与浓硫酸一起回流，在经过结晶提纯而得。2001年，Abbjasovale 等人(RU 2202538,2001)将α -吡咯烷酮和氢氧化钾作用生成的γ-氨基丁酸钾盐转化为 Y-氨基丁酸。总的来说，化学合成法制备GABA由于在生产工艺中使用了一些腐蚀性较强 的溶剂，反应条件剧烈，以及得率较低等原因，存在一定的安全隐患。上述方法不足在于(1)水解开环反应时间长、转化率不高；(2)反应过程繁琐、中间产生大量的杂质，一次合格率低，综合成本高。(3)分离方法主要采用离子交换树脂法，分离时间长，设备利用率低，成本居高不 下。2、生物合成法1961年，陈志民等(生物化学与生物物理学报，Vol. 1，No. 2，1961)利用大肠杆菌El、E2、E3、E4菌种产生的脱羧酶将L-谷氨酸及钠脱羧制备得γ-氨基丁酸。1989年， 阿诺.舒尔茨等人(中国专利，CN125010L 1989)从E. coli DH-I中分离出一种氨基转移 酶将L-谷氨酸的氨基转移至琥珀酸半醛得到Y-氨基丁酸。1997年，Darijel等人(RU 2143002，1997)用E. coli VKPMB-7460或B-7452产生的转氨酶将L-谷氨酸或其钠盐转 化为Y-氨基丁酸。2002年，江波等人(中国专利，CN1392262,2002)用乳酸菌或乳酸菌 和酵母菌混用产生的脱羧酶将L-谷氨酸或其钠盐转化为Y-氨基丁酸。2005年，焦庆才 等人(中国专利，CN1635128,2005)用Ε. coli ASl. 505产生的脱羧酶酶将L-谷氨酸脱 羧制备得Y-氨基丁酸。2005年，梅乐和等人(中国专利，CN167335L2005)用短乳杆菌 CGMCCN0. 1306产生的谷氨酸脱羧酶将谷氨酸钠脱羧制备得γ-氨基丁酸。2008年，曹郁生等人(中国专利，CN101333548,2008)利用MRS液体培养基将短 乳杆菌活化后，在MRSG发酵培养基中富集培养离心后即为含Y-氨基丁酸的溶液。2009 年，半谷吉识等人(中国专利，CN101389751，2009)通过从未精制的酱油中分离即使在培养 开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下仍然能够生产GABA的乳酸菌凝乳酶乳酸 杆菌(Lactobacillus rermini)，并在将乳酸菌接种到含有L-谷氨酸和/或其盐的培养基 中之后对其进行培养，来获得含有GABA的培养混合物。2010年，李荣杰等人(中国专利， CN101705261A，2010)将经过培养的Y _氨基丁酸生产菌株接种到发酵罐中的发酵培养基 中培养，进行有氧、厌氧两段组合发酵，发酵过程中分段控温，在对氧的需求上采取分段调 控的手段，使得Y-氨基丁酸生产菌株在厌氧状态下代谢产生Y-氨基丁酸。因此相比较 而言，生物法比化学法相比较而言安全度高、产品收率高具有更广阔的应用前景。而目前我 国Y-氨基丁酸的生产成本较高，得率较低，副产物多，不能直接用于食品和医药工业。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998) 制备Y -氨基丁酸的方法，从而提供了一种高效、低成本的酶法制备氨基丁酸的方法。本专利技术的高产4-丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998)，是从黄泥田、 红泥田、黄泥砂田、泥质田或黄斑田等若干种土壤中采集，采样深度为0 15cm。属大肠杆 菌Escherichia coli菌株，命名为HHSW-16，显微镜观察菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散；有周鞭毛，镜检可见呈圆周运动；发酵产酸产气 ’属 于革兰氏阳性菌，兼性厌氧。该菌株于保藏日期2010年7月7日，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC No. 3998。本专利技术的高产4- 丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998)是从土壤中 分理出若干菌种，以α -吡咯烷酮为唯一碳源，在含Na2HPO4 · 12H20、KH2PO4, MgSO4 · 7Η20、 CaCl2 ·2Η20,FeSO4 ·7Η20,ZnSO4,NH4Cl和琼脂的固体培养基中筛选得到到的具有高产4- 丁 内酰胺水解酶的菌株，命名为HHSW-16。本专利技术的利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998)制备 Y “氨基丁酸的方法，其包括下述步骤(1)摇瓶种子培养将菌株HHSW-16 (保藏号CGMCC No. 3998)接种于如下种子瓶培养基中碳源为牛肉膏、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和柠檬酸中的至少一种，浓度5-20g/L;氮源为酵母膏、玉米浆和蛋白胨中的至少一种，浓度10-30g/L;无机盐为 Na2HPO4 · 12Η204-7· 5g/L、KH2PO4 1. 0-2. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5g/L、CaCl2 · 2H20 5-15mg 和 FeSO4 ·7Η202-10π^ ；接种后于 25_45°C、pH6. 0-7. 5、摇床转速 140-250rpm 下培养 18-24h ；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产４－丁内酰胺水解酶的菌株，该菌株来源于黄泥田、红泥田、黄泥砂田、泥质田或黄斑田土壤中，并通过筛选分离而得，其特征在于：属于革兰氏阳性菌，兼性厌氧，显微镜观察菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散；有周鞭毛，镜检可见呈圆周运动；发酵产酸产气；属大肠埃希氏菌菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ），命名为ＨＨＳＷ－１６，保藏号为：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３９９８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋光玉，刘洋，郑向辉，白莹，秦秀秀，
申请(专利权)人：安徽华恒生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]