【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
所公开的专利技术一般为生物工程组织领域，并具体地生物工程毛囊组织领域。
技术介绍
0、专利技术背景
1、毛囊(hf)是一种复杂的“微器官”，由多种类型的细胞组成，包括上皮细胞、间充质细胞和神经嵴细胞。hf中的一个间充质细胞群——真皮乳头(dp)细胞——被认为对于hf形成和出生后毛发生长期间诱导上皮细胞至关重要(driskell等人,2011)。上皮和间充质起源细胞之间在空间和时间上的适当通讯和相互作用导致了在发育、生长和创伤修复期间毛发的生成、维持和更新。在hf发育的早期阶段期间，dp形成为间充质凝聚物，该间充质凝聚物收缩为细胞小球，落至毛囊基部，并在整个毛发生长期保持嵌入。dp通过表达涉及wnt、fgf、头蛋白和shh的信号传导分子而继续向上皮区室发出信号，从而促进hf形成、再生和后续毛发生长(ohyama等人,2010；reddy等人,2001)。
2、尽管在出生后没有新的毛囊形成，但毛囊下部终生保持从再生(毛发生长初期(anagen))、退化(毛发生长中期(catagen))到静止(毛发生长静止期(telogen))的周期性生长，以生成新的毛干。然而，由内部或外部触发引起的hf逐渐小型化将导致毛发生长初期缩短以及毛发数量减少，并最终发展为脱发(premanand&reena rajkumari,2018)。
3、毛发不仅具有有用的生物功能，如防止有害要素以及分散汗腺产物，而且在我们的社会中也具有社会心理重要性。虽然脱发本身并不危及生命，但受影响的个体却始终经历巨大的心
4、已经开发出多种脱发治疗法，包括药物、植物提取物以及光疗，但大多数目前的秃发治疗法远不能令人满意——带来相当大的副作用或者具有有限且暂时的效应，主要是针对具有轻度秃发症状的患者(sadick等人,2017)。手术治疗使用从安全头皮区收采的小块毛囊进行自体毛发移植。然而，移植的成功依赖于足够的供体供应，其中供体hf的有限可得性是瓶颈之一，更不用说痛苦的收采规程、劳动密集性，以及规程的较高成本。
5、现有治疗法的局限性驱使寻求更好的治疗替代方案来解决这种尚未满足的医疗需求，其中基于干细胞的组织工程学正在成为一种有前景性的方法。尽管使用鼠毛囊真皮乳头细胞与上皮细胞联合在鼠皮肤中从头毛发再生已展示取得成功，但人毛囊的重建却尚未成功(castro&logarinho,2020)。由于复杂的三维组织和多种信号传导相互作用，对于生成重现关键的毛发特异性标记和毛发诱导潜能的生物工程人毛囊的尝试一直很困难。用于建立生理相关的工程毛囊的挑战包括人毛囊细胞表型的维持、掺入不同微环境因子的限定培养条件的开发，以及能够实现有效的上皮-间充质相互作用并模拟人毛囊三维构型的适当结构设计。
6、因此，本专利技术的一个目的是提供制备生物工程毛囊的方法。
7、本专利技术的另一个目的是提供生物工程毛囊。
8、本专利技术的另一个目的是提供在体外使用生物工程毛囊的方法。
9、本专利技术的另一个目的是提供在体内使用生物工程毛囊的方法。
10、本专利技术的另一个目的是提供使用生物工程毛囊来鉴定用于治疗天然毛囊和脱发的药物和疗法的方法。
11、对已包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、文章等的任何讨论均不应视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或者是在本申请的每项权利要求的优先权日之前就存在的本公开有关的领域中的公知常识。
技术实现思路
1、公开了组合物和方法，该组合物和方法涉及由间充质细胞和细胞外基质构成的微球、此类微球的含角质形成细胞形式，以及由此类微球产生的生物工程毛囊。已发现，通过平衡间充质细胞-基质混合物中的间充质细胞和细胞外基质的比例，并且通过孵育特定范围的小体积的间充质细胞-基质混合物，可以形成具有有用特性的间充质细胞-基质微球。最显著地，所得的间充质细胞-基质微球特别适合用于产生具有天然毛囊特征的生物工程毛囊。
2、公开了产生生物工程毛囊的方法，该方法包括：
3、通过将间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴分配到容器中并且孵育该液滴而形成包含间充质细胞和细胞外基质的微球，由此形成间充质细胞-基质微球；
4、在补充因子的存在下，在容器中培养间充质细胞-基质微球；
5、在靠近间充质细胞-基质微球之处，将上皮细胞的悬浮物的液滴分配到容器中以形成间充质微球-上皮细胞混合物，并且培养间充质微球-上皮细胞混合物；以及
6、将容器中的培养基更换为表皮化培养基并且培养，由此产生生物工程毛囊。
7、在一些形式中，并且更具体地，该方法可以包括通过将间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴分配到容器中并且在25℃至39℃、35℃至39℃，或优选地37℃的温度下任选地具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中，在培养容器中孵育液滴1小时至100小时、5小时至50小时，或优选地8小时至30小时，来形成包含间充质细胞和细胞外基质的微球，由此形成间充质细胞-基质微球；
8、在补充因子的存在下，在容器中培养间充质细胞-基质微球；
9、在靠近间充质细胞-基质微球之处，将上皮细胞的悬浮物的液滴分配到容器中以形成间充质微球-上皮细胞混合物，并且培养间充质微球-上皮细胞混合物；以及
10、将容器中的培养基更换为表皮化培养基，并且在35℃至39℃下任选地具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中培养1至20天，或优选地3至10天，由此产生生物工程毛囊。
11、在一些形式中，间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选地2.0至3.0μl的体积。在一些形式中，间充质细胞和细胞外基质的悬浮物包含密度为1x 104至1x 107个细胞/ml，或优选地1x 105至1x 106个细胞/ml的间充质细胞，以及浓度为0.01mg/ml至2.0mg/ml，或优选地0.05mg/ml至0.5mg/ml的细胞外基质。
12、在一些形式中，间充质细胞是人真皮乳头细胞(dpc)、人间充质干细胞、人成纤维细胞或其组合。在一些形式中，细胞外基质包含胶原、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、玻连蛋白或其组合。在一些形式中，细胞外基质包含胶原或基本上由胶原组成。
13、在一些形式中，培养容器包含在培养平台中，其中培养平台为384孔培养板、定制88孔微孔或基于pdms的微孔。在一些形式中，补充因子包含fgf、hgf、wnt、bmp、pdgf或其组合。
14、在一些形式中，将间充质细胞-基质微球在25℃至39℃，优选地37℃下在具有3.5％至6％ co本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.产生生物工程毛囊的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μL、1.0至5.0μL，或优选2.0至3.0μL的体积。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述间充质细胞和细胞外基质的悬浮物包含密度为1x 104至1x 107个细胞/ml的间充质细胞，以及浓度为0.01mg/ml至3.0mg/ml或0.01mg/ml至2.0mg/ml，优选0.05mg/ml至0.5mg/ml的细胞外基质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞是人真皮乳头细胞(DPC)、人间充质干细胞、人成纤维细胞或其组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含胶原、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、玻连蛋白或其组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含胶原或基本上由胶原组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述培养容器包含384孔培养板、定制88孔微
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述补充因子包含FGF、HGF、Wnt、BMP、PDGF或其组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞-基质微球在25℃至39℃，优选37℃下，在具有3.5％至6％CO2的湿润气氛中，在补充因子存在下，在所述容器中培养1至100小时，优选12小时至30小时。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μL、1.0至5.0μL，或优选2.0至3.0μL的体积，并且优选地所述悬浮物含有密度为1x 104至1x 107个细胞/ml，或优选1x 105至1x 106个细胞/ml的上皮细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将所述间充质微球-上皮细胞混合物在35℃至39℃下，在具有3.5％至6％CO2的湿润气氛中，培养1小时至100小时、5小时至50小时，或优选18小时至30小时。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞是人表皮角质形成细胞、人毛囊角质形成细胞、人表皮祖细胞或干细胞、人iPSC衍生的上皮细胞或其组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中间充质细胞与上皮细胞的比率为0.1:1至10:1，优选1:1。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中将间充质细胞和细胞外基质的所述液滴孵育过夜，其中将所述间充质细胞-基质微球培养过夜，并且其中将所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物培养过夜。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物在表皮化培养基中培养8天。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中间充质细胞和基质的所述液滴含有约500至约10000个细胞、约1000至约5000个细胞或约1000至约3000个细胞，或优选约1250个间充质细胞。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物含有至少一个或一个间充质细胞-基质微球，以及约500至约10000、约1000至约5000或约1000至约3000，或优选约1250个上皮细胞。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞-基质微球具有指示其毛发诱导性的一个或多个特征，优选地，指示所述间充质细胞-基质微球的毛发诱导性的所述一个或多个特征包括碱性磷酸酶的表达、多能蛋白聚糖的表达、纤连蛋白的表达、Wnt信号传导途径的激活、BMP信号传导途径的激活或其组合。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊具有指示毛发诱导性的一个或多个特征，优选地，指示所述生物工程毛囊的毛发诱导性的所述一个或多个特征包括碱性磷酸酶的表达、纤连蛋白的表达或其组合。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊具有指示上皮细胞增殖的一个或多个特征，优选地，指示上皮细胞增殖的所述一个或多个特征包括细胞角蛋白的表达、整合素α6的表达或其组合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊具有指示毛发分化的一个或多个特征，优选地，指示毛发分化的所述一个或多个特征包括角蛋白75的表达。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊中的细胞具有...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.产生生物工程毛囊的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选2.0至3.0μl的体积。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述间充质细胞和细胞外基质的悬浮物包含密度为1x 104至1x 107个细胞/ml的间充质细胞，以及浓度为0.01mg/ml至3.0mg/ml或0.01mg/ml至2.0mg/ml，优选0.05mg/ml至0.5mg/ml的细胞外基质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞是人真皮乳头细胞(dpc)、人间充质干细胞、人成纤维细胞或其组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含胶原、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、玻连蛋白或其组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含胶原或基本上由胶原组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述培养容器包含384孔培养板、定制88孔微孔或基于pdms的微孔。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述补充因子包含fgf、hgf、wnt、bmp、pdgf或其组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞-基质微球在25℃至39℃，优选37℃下，在具有3.5％至6％co2的湿润气氛中，在补充因子存在下，在所述容器中培养1至100小时，优选12小时至30小时。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选2.0至3.0μl的体积，并且优选地所述悬浮物含有密度为1x 104至1x 107个细胞/ml，或优选1x 105至1x 106个细胞/ml的上皮细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将所述间充质微球-上皮细胞混合物在35℃至39℃下，在具有3.5％至6％co2的湿润气氛中，培养1小时至100小时、5小时至50小时，或优选18小时至30小时。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞是人表皮角质形成细胞、人毛囊角质形成细胞、人表皮祖细胞或干细胞、人ipsc衍生的上皮细胞或其组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中间充质细胞与上皮细胞的比率为0.1:1至10:1，优选1:1。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中将间充质细胞和细胞外基质的所述液滴孵育过夜，其中将所述间充质细胞-基质微球培养过夜，并且其中将所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物培养过夜。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物在表皮化培养基中培...
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