【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及分枝杂交链式反应免疫检测试剂及检测方法。
技术介绍
1、随着全球经济的发展、人们保健意识的提高以及全球多数国家医疗保障政策的完善，体外诊断行业持续发展。免疫诊断在体外诊断行业中占据重要的地位，通过抗原抗体特异性结合实现检测，可检测项目主要是人体各种蛋白、各种抗体及病原微生物抗原等蛋白类检测。临床常用的体外诊断手段主要包括核酸扩增法、免疫荧光法、免疫化学发光法、比色法、免疫层析法、酶联免疫等，目前免疫化学发光技术是公认的最先进的体外诊断技术之一。化学发光免疫分析法存在诸多缺点：
2、a.直接化学发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性；
3、b.间接化学发光因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不好；
4、c.电化学发光交叉污染为潜在问题，对环境因素和其它非特异性反应过于敏感。
5、d.化学发光免疫技术门槛高，研发难度大，目前国内化学发光免疫分析产品70％以上市场都被国外公司占据，高端技术被垄断，试剂成本较高。
6、随着生物技术的发展，非线性杂交链式反应技术(bhcr)作为一种通用的信号放大体系，在体外诊断检测方面表现出巨大的潜力。基于bhcr技术的诊断试剂利用引物(引发链f dna)将基质上的淬灭基团通过链置换反应从双链上置换下来，释放出荧光基团的荧光，引起反应体系自组装形成荧光纳米级树枝状结构，将生物信号呈指数级放大，从而实现微量蛋白质及小分子等疾病标志物的高灵敏度检测。bhcr信号放大策略具有操作简单、特异性高、动态灵活可
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供分枝杂交链式反应免疫检测试剂及检测方法，从而具有良好的准确性、稳定性和灵敏性。
2、本专利技术提供了用于免疫检测的信号报告的分枝杂交链式反应试剂，其包括：1条引发链、4条基底链和2条辅助链，其中：
3、引发链f的5’端标记生物素；
4、基底链s1和基底链s4的5’端标记荧光基团；
5、基底链s2和基底链s3的5’端标记荧光基团。
6、本专利技术所述的分枝杂交链式反应试剂中，在引发链f的5’端标记生物素，使其与标记链霉亲和素的检测抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)结合，从而实现对免疫学检测结果进行信号放大。
7、本专利技术实施例中，本专利技术所述的分枝杂交链式反应试剂中，
8、引发链f包括：polya、片段b、片段a和片段d；
9、基底链s1包括：[片段c+片段e]n、片段d*、片段a*、片段b*；
10、基底链s2包括：间隔片段1、片段a、片段d和[片段c]n；
11、基底链s3包括：[片段e*+片段c*]n-1、片段b、片段a和片段d；
12、基底链s4包括：片段d*、片段a*、[间隔片段2+片段c]n-1‘；
13、辅助链h1包括：[片段c]n和片段d*；
14、辅助链h2包括：片段a和片段f。
15、片段a与片段a*反向互补，片段b与片段b*反向互补，片段c与片段c*反向互补，片段d与片段d*反向互补，片段e与片段e*反向互补，片段f与片段d*部分互补；n为2～5的整数。
16、本专利技术对各片段的序列不做限定，只要能满足互补关系且不发生自配或非特异性杂交即可。一些实施例中，片段a和片段a*的长度为10～15bp。一些实施例中，片段b和片段b*的长度为5～10bp。一些实施例中，片段c和片段c*的长度为15～20bp。一些实施例中，片段d和片段d*的长度为5～10bp。一些实施例中，片段e和片段e*的长度为5～10bp。一些实施例中，片段f比片段d短2～3bp。一些实施例中，间隔片段1的长度为1～3bp，间隔片段2的长度为2～5bp。
17、该系统由双链底物sa、sb，辅助单链h1、h2以及引发链f构成，其中sa由s1、s2部分杂交组成，sb由s1、s2部分杂交组成，s1、s3链在未标记的一端存在一个暴露的片段。加入引物链f后触发反应，首先引物与s1暴露的片段杂交，使得s1和s2部分解离，第一个环被打开，此时辅助单链h1可与解离的s2杂交，进而打开第二个环，并与s2形成副产物，释放荧光基团。打开的两个环上均含有底物sb的结合位点，在辅助单链h2的帮助下，成功脱去两条带淬灭剂的s4，从而释放第二个和第三个荧光基团。两个底物sb打开的环上的序列又可与底物sa暴露的片段杂交，触发下一轮反应。随着反应的不断进行，越来越多的荧光标记的触发序列从淬灭的底物中释放出来，形成组装的dna树状大分子的链状分支生长和荧光强度的指数增加。
18、一些具体实施例中，采用如下序列的判断能够获得更好的检测效果。
19、片段a的核酸序列如seq id no:1所示，其为acacgtagttgatg；
20、片段b的核酸序列如seq id no:2所示，其为tgacgac；
21、片段c的核酸序列如seq id no:3所示，其为cgtatgtgctatatgtc；
22、片段d的核酸序列如seq id no:4所示，其为tcagactt；
23、片段e的核酸序列如seq id no:5所示，其为tcctcct；
24、片段f的核酸序列如seq id no:6所示，其为aagtct。
25、本专利技术中，polya中a的个数为3～10个，在本专利技术实施例中，a的个数为5个。
26、在本专利技术实施例中，间隔片段1的长度为2bp，其为ac，间隔片段2的长读为3bp，其为cct。
27、一个具体实施例中，
28、引发链f的核酸序列如seq id no:7所示；
29、基底链s1的核酸序列如seq id no:8所示；
30、基底链s2的核酸序列如seq id no:9所示；
31、基底链s3的核酸序列如seq id no:10所示；
32、基底链s4的核酸序列如seq id no:11所示；
33、辅助链h1的核酸序列如seq id no:12所示；
34、辅助链h2的核酸序列如seq id no:13所示。
35、本专利技术中，基底链s1的5`端标记的荧光基团与基底链s3的3`端标记荧光基团，所述荧光基团选自amca、pacific blue、atto 425、fam、alexa fluor 488、tet、joe、hex、quasar 570、cy3、tamra、rox、texas red、atto 590、cy5、quasar 670或cy5.5中任一种。
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【技术保护点】
1.用于免疫检测的信号报告的分枝杂交链式反应试剂，其包括：1条引发链、4条基底链和2条辅助链，其中：
2.根据权利要求1所述的分枝杂交链式反应试剂，其中：
3.根据权利要求2所述的分枝杂交链式反应试剂，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的分枝杂交链式反应试剂，其特征在于，
5.根据权利要求1～4任一项所述的分枝杂交链式反应试剂，其特征在于，
6.权利要求1～5任一项所述的分枝杂交链式反应试剂在制备免疫学检测试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测试剂为基于夹心免疫法或竞争免疫法反应的免疫学检测试剂。
8.免疫学检测试剂，其特征在于，包括：试剂1[M]、试剂2[R1a]、试剂3[R1b]、试剂4[R1c]、试剂5[R1d]；
9.根据权利要求8所述的免疫学检测试剂，其特征在于，
10.根据权利要求8或9所述的免疫学检测试剂，其特征在于，
11.权利要求8～10任一项所述免疫学检测试剂的制备方法，包括：
12.根据权利要
13.根据权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于，
14.一种免疫学检测方法，其包括：
15.免疫学检测试剂，其特征在于，包括：试剂1[M]、试剂2[R1a]、试剂3[R1b]、试剂4[R1c]、试剂5[R1d]；
16.根据权利要求15所述的免疫学检测试剂，其特征在于，所述磁微粒的粒径为1～3μm。
17.根据权利要求15或16所述的免疫学检测试剂，其特征在于，
18.权利要求15～17任一项所述免疫学检测试剂的制备方法，包括：
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，
20.根据权利要求18或19所述的制备方法，其特征在于，
21.一种免疫学检测方法，其包括：
...【技术特征摘要】
1.用于免疫检测的信号报告的分枝杂交链式反应试剂，其包括：1条引发链、4条基底链和2条辅助链，其中：
2.根据权利要求1所述的分枝杂交链式反应试剂，其中：
3.根据权利要求2所述的分枝杂交链式反应试剂，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的分枝杂交链式反应试剂，其特征在于，
5.根据权利要求1～4任一项所述的分枝杂交链式反应试剂，其特征在于，
6.权利要求1～5任一项所述的分枝杂交链式反应试剂在制备免疫学检测试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测试剂为基于夹心免疫法或竞争免疫法反应的免疫学检测试剂。
8.免疫学检测试剂，其特征在于，包括：试剂1[m]、试剂2[r1a]、试剂3[r1b]、试剂4[r1c]、试剂5[r1d]；
9.根据权利要求8所述的免疫学检测试剂，其特征在于，
10.根据权利要求8或9所述的免疫...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙若为，张伯伦，孙一绮，
申请(专利权)人：湖南早晨纳米机器人有限公司，
类型：发明
国别省市：
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