【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程，具体涉及用于产肠毒素大肠杆菌k99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用。
技术介绍
1、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic escherichia coli,etec)是一种能够引起人和多种动物腹泻的致病性大肠杆菌。本病多发于幼龄动物，在猪群中主要导致7日龄以内仔猪发生剧烈腹泻和脱水，传播迅速，发病率和死亡率均较高，称为仔猪黄痢；10-30日龄仔猪多发白痢，病死率不高，但导致仔猪发育不良，逐渐消瘦，甚至造成僵猪的情况，给养殖场造成巨大经济损失，因此，研究和创制针对该病的疫苗具有重要意义(张凡庆2022)。
2、活载体疫苗是将目的抗原编码基因通过分子生物学手段导入活载体(无或弱毒的细菌或病毒)，构建重组菌(毒)株，使目的基因随着重组菌(毒)株在宿主体内的增殖而大量表达,从而诱发相应的免疫保护应答。乳酸乳球菌(lactococcus lactic)是乳酸菌的典型菌种之一，具有生长迅速、易于操作及安全无毒等优点，目前已获得其全部基因组序列，逐渐成为表达外源蛋白和作为活载体疫苗载体的理想选择(王琛2019)。然而，乳酸菌具有较高的生物学与遗传基因型多样性，不同外源基因的表达量差异较大甚至不表达，相同基因在不同宿主菌中表达水平也有所差异，刺激机体产生的细胞免疫和体液免疫水平也不同，抗原在重组菌株表面展示的量同样存在较大的差异，而蛋白表达量是载体疫苗发挥效果的关键因素，因而在实际使用过程中，免疫动物收获的效果也参差不齐，这也是乳酸菌载体疫苗发展的难点之一(刘琼等2019)。
4、针对本病的亚单位疫苗一直以来是备受关注的疫苗类型，其具有广谱性强，免疫原性高，动物应激反应小等优点，但是由于细菌本身抗原蛋白制备较为困难，存在菌株表达量低、不易获得大量可溶性蛋白、提纯成本较高、免疫效果达不到预期等问题，目前为止还没有产品在临床使用。弱毒活疫苗存在毒力返强风险，并且往往只对同源菌株有效，加之全世界对细菌弱毒苗研究较少等，目前也没有疫苗可供使用(夏芃芃等2016；杨德鸿等2019；bourgeois et al.2016)。因此，当前对于etec的防控，仍急需一种行之有效的疫苗方案。
5、针对上述问题，本专利技术提供了用于产肠毒素大肠杆菌k99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗，该疫苗通过口服免疫方式进行免疫，避免了疫苗注射带来的应激反应，同时极大的发挥了黏膜免疫的效果，抵抗大肠杆菌病的感染。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物为分别表达seq id no.2，seq id no.4和seq id no.6的乳酸乳球菌nz3900。
2、本专利技术的另一个目的在于提供了上述乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。
3、为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
4、一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达seq id no.2的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，表达seq id no.的4重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-stb-acm和表达seq id no.6的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-fanc-acm。
5、以上所述的方案，优选的，所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，是将seq id no.1所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得。
6、所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-stb-acm是将seqid no.3所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得。
7、所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-fanc-acm是将seqid no.5所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得。
8、以上所述的方案，优选的，三种重组乳酸乳球菌的有效菌含量的比例为1～2：1～2：1～2。
9、本专利技术的保护范围还包括：上述乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。优选的，所述的产肠毒素大肠杆菌的菌毛型为k99。
10、与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
11、1.本专利技术首次提供了可口服的产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichia coli,ete c)，利用该疫苗小鼠免疫攻毒实验，7天日观察疫苗的保护率可以达到100％，仔猪免疫后攻毒发现能够全部保护不发生腹泻。
12、2.本专利技术专门针对乳酸乳球菌nz3900，设计的产肠毒素大肠杆菌抗原展示序列，该序列可在乳酸乳球菌nz3900这一展示载体上大量而稳定的表达，同时动物服用后达到良好的免疫效果。
13、3.本专利技术由于是口服疫苗，免疫方式简单，口服拌料容易规模化实施，避免注射引起的应激反应，可以有效的预防仔猪黄白痢的发生。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1. 一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达SEQ ID NO.2的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-stA-ACM，表达SEQ ID NO. 4重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-stB-ACM和表达SEQ ID NO.6的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-fanC-ACM。
2. 根据权利要求1的混合物，其特征在于：所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-stA-ACM，是将SEQ ID NO.1所示基因导入乳酸乳球菌NZ3900获得；
3.根据权利要求1所述的混合物，所述的三种重组乳酸乳球菌的有效菌含量的比例为1~2：1~2：1~2。
4.权利要求1所述的乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的产肠毒素大肠杆菌的菌毛型为K99。
【技术特征摘要】
1. 一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达seq id no.2的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，表达seq id no. 4重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-stb-acm和表达seq id no.6的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-fanc-acm。
2. 根据权利要求1的混合物，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王湘如，于江旭，付霁阳，刘洪硕，金言成，吴姝璇，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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