【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵工程，尤其是指一种三菌耦合发酵合成乳酰-n-三糖ⅱ的方法。
技术介绍
1、母乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是母乳中含量第三丰富的固体成分，在婴儿生长发育过程中有着积极的影响。乳酰-n-三糖ⅱ(lacto-n-trioseⅱ，lntⅱ)由n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetylglucosamine，glcnac)和乳糖通过β-1,3-糖苷键连接而成，它是hmos的核心结构单元。lntⅱ不仅可以通过tlr途径激活nf-κb，即lntⅱ在一定程度上显示出对免疫细胞的调控作用，还能与人的肠道上皮细胞发生作用，有效减少炎症的发生率。然而，天然母乳和牛乳中lntⅱ的丰度极低，不能满足大规模合成母乳寡糖的需求，因此，lntⅱ的廉价生产对多样化母乳寡糖的商业化生产具有重要意义。
2、目前lntⅱ合成方法有化学法、酶催化法和微生物发酵法。尹晓娟利用化学法来以乳糖和glcnac为起始原料，采用“1+2”的策略获得lntⅱ，收率为14％。由于化学法需要激活、保护和去保护等多个步骤，且收率低，导致化学法并不适合工业化生产lntⅱ。blixt等鉴定出一种来自脑膜炎奈瑟球菌(neisseria meningitidis)的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶(lgta)，可以催化尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)上的glcnac残基转移到乳糖受体生成lntⅱ(glycobiology,1999)；liu等从巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)中异源表达并纯化出
3、近年来，通过构建细胞工厂来生产lntⅱ受到了极大的关注。dong等构建了一株用于生产lntⅱ和乳酰-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)的重组枯草芽孢杆菌，过表达关键前体udp-glcnac和尿苷二磷酸半乳糖代谢途径中的相关基因，并利用木糖诱导的crispri干扰系统调控竞争途径中靶基因沉默，经优化培养条件后，通过3l发酵罐分批补料发酵的培养方式同时产生lntⅱ和lnnt的效价分别为2.64-2.98g/l和4.52-5.41g/l(journal of agricultural and food chemistry,2020)。此外，priem等在e.coli jm109(pcwlgta)(lacy+lacz-)中过表达来源于n.meningitidis的lgta基因，以甘油替代葡萄糖为碳源生产lntⅱ，最终lntⅱ产量为6g/l，产率73％(glycobiology,2002)。
4、单一细胞工厂生产lntⅱ的代谢途径复杂，且产物难以向胞外释放，将会导致反馈抑制，从而影响最终产量。因此，如何优化发酵生产体系组成与工艺以实现lntⅱ的高效合成成为亟需解决的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种三菌耦合发酵产乳酰-n-三糖ⅱ的方法，利用含有n-乙酰氨基己糖1-位激酶基因nahk的e.coli jm109(de3)/pet28a-nahk将glcnac和atp一步转化成glcnac-1-p。然后构建含udp-hexnac焦磷酸化酶agx1的重组大肠杆菌。将自主构建的e.coli jm109(de3)/pet28a-nahk和e.coli jm109(de3)/pet28a-agx1与含有lgta基因的e.coli jm109(de3)/pet28a-lgta耦合，建立三菌株耦合发酵合成lntⅱ的生产体系，并对其体系进行优化，得到最佳发酵条件。
2、本专利技术的目的是提供一种三菌耦合发酵合成乳酰-n-三糖ⅱ的方法，以乳糖和n-乙酰氨基葡萄糖为底物，利用三种以大肠杆菌为宿主的基因工程菌耦合发酵，基因工程菌包括：
3、表达n-乙酰氨基己糖1-位激酶nahk的第一基因工程菌；
4、表达udp-hexnac焦磷酸化酶agx1的第二基因工程菌；
5、表达β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶lgta的第三基因工程菌。
6、进一步地，乳糖在发酵体系中的浓度为80-140mmol/l。
7、优选地，乳糖的浓度为80mmol/l。
8、进一步地，n-乙酰氨基葡萄糖在发酵体系中的浓度为80-140mmol/l。
9、优选地，n-乙酰氨基葡萄糖的浓度为80mmol/l。
10、进一步地，上述第一、第二和第三基因工程菌在发酵体系中的比例为(1-2)：(1-2)：(1-2)。
11、进一步地，发酵体系中添加辅因子atp和utp。
12、进一步地，atp在发酵体系中的浓度为40-60mmol/l。
13、优选地，atp的浓度为50mmol/l。
14、进一步的，utp在发酵体系中的浓度为60-90mmol/l。
15、优选地，utp的浓度为60mmol/l。
16、进一步地，发酵体系中添加二价金属离子。
17、优选地，发酵体系中添加mg2+。
18、优选地，mg2+的浓度为20mmol/l。
19、进一步地，发酵时间为12-28小时。
20、优选地，发酵时间为28小时。
21、进一步地，发酵温度为30-37℃。
22、优选地，发酵时间为30℃。
23、本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
24、本研究通过自主构建的三株工程菌e.coli jm109(de3)/pet 28a-nahk、e.colijm109(de3)/pet28a-agx1及e.coli jm109(de3)/pet28a-lgta耦合发酵，成功将廉价易得的底物glcnac和乳糖转化为具有高附加值的lntⅱ。通过对合成体系进行层层递进式的优化，最终获得lntⅱ的最大产量为3.03g/l，相较优化前提高了接近4倍。
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1.一种三菌耦合发酵合成乳酰-N-三糖Ⅱ的方法，其特征在于，以乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖为底物，利用三种以大肠杆菌为宿主的基因工程菌耦合发酵，所述基因工程菌包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乳糖在发酵体系中的浓度为80-140mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰氨基葡萄糖在发酵体系中的浓度为80-140mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一、第二和第三基因工程菌在发酵体系中的比例为(1-2)：(1-2)：(1-2)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵体系中添加辅因子ATP和UTP。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述ATP的浓度为40-60mmol/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述UTP的浓度为60-90mmol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵体系中添加二价金属离子。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵时间为12-28小时。p>
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵温度为30-37℃。
...【技术特征摘要】
1.一种三菌耦合发酵合成乳酰-n-三糖ⅱ的方法，其特征在于，以乳糖和n-乙酰氨基葡萄糖为底物，利用三种以大肠杆菌为宿主的基因工程菌耦合发酵，所述基因工程菌包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乳糖在发酵体系中的浓度为80-140mmol/l。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述n-乙酰氨基葡萄糖在发酵体系中的浓度为80-140mmol/l。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一、第二和第三基因工程菌在发酵体系中的比例为(1-2)：(1-2)：(1-2)。...
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