【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物及其制备方法与应用。
技术介绍
1、灰葡萄孢菌是一种世界范围的植物灰霉病病原菌，能导致500多种植物病害，其中农作物超过200种。目前对灰葡萄孢菌还没有有效的防治方法，喷施化学杀菌剂仍然是生产上主要的防治手段。但是化学农药的长期大量使用，不仅造成生态环境污染、影响食品安全，还导致病原真菌抗药性逐渐增强。因此，研制绿色防控技术非常迫切。
2、rna干扰(rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(dsrna)或小发夹rna(shrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。在抗真菌研究中，外源的dsrna或shrna能够被真菌所主动吸收，在dicer作用下加工成sirna而启动rnai信号通路，引发重要基因沉默。如果目标mrna在真菌体内编码的是一个基本功能性蛋白，其表达受阻将导致真菌死亡。rnai抗真菌技术有特异性强、效率高、操作简便、不易产生抗性及对环境友好等优点。rnai具有很强的特异性，它只降解同源序列的mrna，对其他序列的表达没有影响。因此可以针对特定真菌设计非常专一性的dsrna或shrna而不会影响环境中的其他有益微生物，也不会危害其他动植物和人类健康。鉴于上述的众多优点，rnai技术已成为研究基因功能及新型抗真菌技术的新工具。
3、然而，rnai技术在推广应用上仍然存在短板，其中一个突出的问题便是rna分子递送进入细胞的效率过低。此外，rnai技术的脱靶率也存在争议。
4、因此，现有技术
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供特异性靶向灰葡萄孢菌的几丁质、麦角甾醇表达的bi-shrna与细胞穿膜肽结合的复合物及制备方法与应用,通过将干扰性bi-shrna与细胞穿膜肽结合形成复合物，在抑制灰葡萄孢菌的几丁质、麦角甾醇的表达的同时，提升rna分子递送进入细胞的效率。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其中，所述shrna与细胞穿膜肽复合物包括：抑制灰葡萄孢菌的几丁质、麦角甾醇表达的干扰性bi-shrna以及与所述干扰性bi-shrna依靠正负电结合的细胞穿膜肽。所述细胞穿膜肽可以为细胞穿膜肽kh9-bp100。其中，干扰性bi-shrna表面带有负电荷，细胞穿膜肽的表面带有正电荷，通过正负电荷的相互作用，使得干扰性bi-shrna与细胞穿膜肽结合在一起，形成复合物。
4、以下作为本专利技术的优选技术方案，但不作为对本专利技术提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本专利技术的目的和有益效果。
5、作为优选的技术方案，所述的抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其中，所述干扰性bi-shrna依次包括：针对几丁质的靶序列、环形结构序列、针对几丁质的靶序列的互补序列、连接序列、针对麦角甾醇的靶序列、环形结构序列、针对麦角甾醇的靶序列的互补序列；
6、所述几丁质的靶序列为aagtggcatttgacttatatc，所述麦角甾醇的靶序列为aacugucguuagauuguucaa，连接序列为tccgca，环形结构序列为gagaacu。
7、作为优选的技术方案，所述的抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其中，所述干扰性bi-shrna的序列结构如下所示：
8、
9、作为优选的技术方案，所述的抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其中，所述几丁质的核苷酸序列如sseq id no.1所示；所述麦角甾醇的核苷酸序列如sseq idno.2所示。
10、第二方面，一种如上述所述的shrna与细胞穿膜肽复合物的制备方法，所述方法包括：将干扰性shrna、细胞穿膜肽分散至depc水中，得到所述复合物。
11、作为优选的技术方案，所述的shrna与细胞穿膜肽复合物的制备方法，其中，所述干扰性bi-shrna的制备方法，包括步骤：
12、根据几丁质靶基因、麦角甾醇靶基因的序列，分别设计出对应的干扰性sirna序列；
13、根据所述干扰性sirna序列，通过靶序列、环形结构序列、靶序列的互补序列、连接序列设计干扰性shrna序列；
14、将所述干扰性shrna序列，连接到质粒载体pet-28a(+)上的酶切位点xbai和blpi之间，得到shrna表达载体；
15、将所述shrna表达载体转入大肠杆菌，生产得到干扰性shrna。
16、第三方面，一种上述所述的抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物在制备灭杀灰葡萄孢菌药物中的应用。
17、有益效果：与现有技术相比，本专利技术提供的一种特异性靶向抑制灰葡萄孢菌几丁质、麦角甾醇表达的干扰性bi-shrna和细胞穿膜肽结合的复合物，其能够持续、稳定、特异性且高效地杀灭灰葡萄孢菌。制备得到的干扰性bi-shrna和细胞穿膜肽结合的复合物即可用于灰葡萄孢菌的防控。具有不易产生抗性及对环境友好等优点。
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1.一种抑制灰葡萄孢菌的shRNA与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述shRNA与细胞穿膜肽复合物包括：抑制灰葡萄孢菌的几丁质、麦角甾醇表达的干扰性bi-shRNA以及与所述干扰性bi-shRNA结合的细胞穿膜肽。
2.根据权利要求1所述的抑制灰葡萄孢菌的shRNA与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述干扰性bi-shRNA依次包括：针对几丁质的靶序列、环形结构序列、针对几丁质的靶序列的互补序列、连接序列、针对麦角甾醇的靶序列、环形结构序列以及针对麦角甾醇的靶序列的互补序列；
3.根据权利要求1所述的抑制灰葡萄孢菌的shRNA与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述干扰性bi-shRNA的序列结构如下所示：
4.根据权利要求1所述的抑制灰葡萄孢菌的shRNA与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述几丁质的核苷酸序列如SSEQ ID NO.1所示；所述麦角甾醇的核苷酸序列如SSEQ IDNO.2所示。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的shRNA与细胞穿膜肽复合物的制备方法，所述方法包括：将干扰性shRNA、细胞穿膜肽分散至DEPC水中，得到
6.根据权利要求5所述的shRNA与细胞穿膜肽复合物的制备方法，其特征在于，所述干扰性bi-shRNA的制备方法，包括步骤：
7.一种如权利要求1-4任一项所述的抑制灰葡萄孢菌的shRNA与细胞穿膜肽复合物在制备灭杀灰葡萄孢菌药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述shrna与细胞穿膜肽复合物包括：抑制灰葡萄孢菌的几丁质、麦角甾醇表达的干扰性bi-shrna以及与所述干扰性bi-shrna结合的细胞穿膜肽。
2.根据权利要求1所述的抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述干扰性bi-shrna依次包括：针对几丁质的靶序列、环形结构序列、针对几丁质的靶序列的互补序列、连接序列、针对麦角甾醇的靶序列、环形结构序列以及针对麦角甾醇的靶序列的互补序列；
3.根据权利要求1所述的抑制灰葡萄孢菌的shrna与细胞穿膜肽复合物，其特征在于，所述干扰性bi-shrna的序列结构如下所示：
【专利技术属性】
技术研发人员：陈若瑜，龙昕姁，冯晓程，黄骏，莫蓓莘，刘学东，陈伟钊，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：
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