【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，尤其是涉及一种基于rad51蛋白的核酸结合偏好序列、单链dna修复模板、应用及基因编辑方法。
技术介绍
1、基因编辑，或称基因组编辑，旨在修改生物体的基因，以提高我们对基因功能的理解，并利用它来开发治疗遗传疾病或获得性疾病的方法。基因编辑可用于校正、引入或删除许多不同类型的细胞和生物体中的几乎任何dna序列。第一个基因编辑技术出现在1900年代后期。此后在2009年，科学家们发现了一种名为crispr的新基因编辑工具，使编辑dna变得前所未有的容易。与将遗传物质随机插入宿主基因组的早期基因工程技术不同，新型基因编辑工具的目标是将片段插入到特定位置。
2、crispr是“成簇规律间隔短回文重复序列”(clustered regularly interspacedshortpalindromicrepeats)的缩写，原核生物(细菌和古生菌)利用它来防止噬菌体病毒的感染。其原理核心是使原核生物能够识别与噬菌体或其他入侵者相匹配的基因序列，并利用专门的酶将这些序列作为破坏目标，这些专门的酶称为crispr相关蛋白cas(crisprassociated proteins)。根据crispr/cas系统的特性，科学家将其改造成了目前最高效的基因组编辑工具。目前，来自streptococcuspyogenes(酿脓链球菌)的crispr/cas9系统应用最为广泛。天然的crispr-cas9系统由三部分组成：spcas9(以下简称cas9)、crrna、tracrrna。其中，crrna和tracrrn
3、尽管crispr系统比旧的基因编辑方法更简单、更快速、更准确，crispr基因编辑系统还并不完美，甚至可能在无意中带来细胞毒性。一，由于脱靶效应的存在，crispr可能会在基因组中编辑错误的位置，这意味着它可以在错误的位点随机引入突变，而不是靶向的基因组位点。二，即使crispr根据需要精确地修改基因组，引入的变化也并不总是导致预期的结果。例如，一些使用crispr对抗hiv的研究立即发现，病毒本身产生了单独的新突变，使其能够逃脱crispr的编辑。三，目前利用crispr造成精确基因编辑的效率还不高，所以临床使用的基因治疗方法还是以回补为主。由于crispr-cas系统(例如cas9)诱导的dsb效率通常非常高，因此dna修复模板介导的修复效率被认为是基因编辑的限制步骤，这使得高效的dna修复模板对于精确基因编辑至关重要。由于单链dna修复模板通常比双链dna修复模板具有更高的修复效率和更低的细胞毒性，因此大多数研究都集中在单链dna模板上。目前大多数关于提高单链dna修复模板效率的策略通常靶向cas9并通过复杂的修饰将单链dna修复模板拴在其上面。然而，这些策略有一些缺点，例如cas9核酸内切酶活性会受到潜在的损害，限制了crispr或单链dna修复模板的递送方式为非病毒系统，以及增加了实验的复杂性和费用。
4、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种基于rad51蛋白的核酸结合偏好序列，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
2、本专利技术的目的之二在于提供包含上述核酸结合偏好序列的单链dna修复模板。
3、本专利技术的目的之三在于提供上述核酸结合偏好序列和单链dna修复模板的应用。
4、本专利技术的目的之四在于提供一种利用上述单链dna修复模板进行基因编辑的方法。
5、为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
6、第一方面，本专利技术提供了基于rad51蛋白的核酸结合偏好序列，所述核酸结合偏好序列包含tcccc序列。
7、本专利技术的专利技术人通过大量的实验筛选并验证发现，包含tcccc序列的单链dna序列与哺乳动物细胞内源蛋白rad51结合效率更高，因此，将包含tcccc的单链dna序列作为rad51蛋白的核酸结合偏好序列。
8、基于上述筛选验证得到的rad51蛋白的核酸结合偏好序列，本专利技术的第二个方面还提供了单链dna修复模板，所述单链dna修复模板非模板同源序列中包括上述的核酸结合偏好序列。
9、由于所述核酸结合偏好序列对哺乳动物细胞内源蛋白rad51结合效率更高，因此将其结合到dna修复模板的5’端，实现所得到的单链dna修复模板对rad51蛋白也能够高效结合。
10、基于上述核酸结合偏好序列和单链dna修复模板的有益效果，本专利技术的第三个方面还提供了二者在基因编辑中的应用。
11、在一些实施方式中，所述基因编辑包括外源基因的基因编辑和内源基因的基因编辑。
12、在一些实施方式中，所述基因编辑包括crispr系统介导的基因编辑，例如crispr/cas9系统、crispr/cas12a系统等，优选为crispr/cas9系统。
13、此外，根据本专利技术的第四个方面，还提供了一种基因编辑方法，包括：将基因编辑系统和上述的单链dna修复模板导入细胞中进行基因编辑。
14、在一些实施方式中，所述细胞包括表达rad51的哺乳动物细胞，优选为hek 293a、hek 293t、hela、u2os、k562、hpb cd34+、nih3t3或ibmdm中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于Rad51蛋白的核酸结合偏好序列，其特征在于，所述核酸结合偏好序列包含TCCCC序列。
2.单链DNA修复模板，其特征在于，所述单链DNA修复模板非模板同源序列中包括权利要求1所述的核酸结合偏好序列。
3.权利要求1所述的基于Rad51蛋白的核酸结合偏好序列或权利要求2所述的单链DNA修复模板在基因编辑中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因编辑包括外源基因的基因编辑和内源基因的基因编辑。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因编辑包括CRISPR系统介导的基因编辑，优选为CRISPR/Cas9系统。
6.一种基因编辑方法，其特征在于，包括：将基因编辑系统和权利要求2所述的单链DNA修复模板导入细胞中进行基因编辑。
7.根据权利要求6所述的基因编辑方法，其特征在于，所述细胞包括表达Rad51的哺乳动物细胞，优选为HEK 293A、HEK 293T、Hela、U2OS、K562、hPB CD34+、NIH3T3或iBMDM中的至少一种。
8.根据权利要求6所
9.根据权利要求6所述的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑系统包括CRISPR系统，优选为CRISPR/Cas9系统。
10.根据权利要求6-9任一项所述的基因编辑方法，其特征在于，在基因编辑系统转入细胞后，还包括筛选和鉴定的步骤。
...【技术特征摘要】
1.基于rad51蛋白的核酸结合偏好序列，其特征在于，所述核酸结合偏好序列包含tcccc序列。
2.单链dna修复模板，其特征在于，所述单链dna修复模板非模板同源序列中包括权利要求1所述的核酸结合偏好序列。
3.权利要求1所述的基于rad51蛋白的核酸结合偏好序列或权利要求2所述的单链dna修复模板在基因编辑中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因编辑包括外源基因的基因编辑和内源基因的基因编辑。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因编辑包括crispr系统介导的基因编辑，优选为crispr/cas9系统。
6.一种基因编辑方法，其特征在于，包括：将基因编辑系统...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘德培，金莹莹，张鹏，陈厚早，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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