【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌检测，尤其涉及一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
1、以最小的损伤杀死体内的病原体。因此，开发用于定位感染病灶，同时治疗真菌感染，减轻炎症的多功能仿生纳米药物来极大地满足临床需求仍具有挑战性。
2、镧系掺杂上转换纳米粒子(ucnps)具有将近红外(nir)激发光转换为可见发射光的能力，近些年来倍受关注。在近红外光照射下，ucnps可以在光敏剂的帮助下产生活性氧(ros)，引起细胞物质如蛋白质和脂质的高度氧化损伤，然而，由于ucnps的识别能力差，产生的ros的寿命极短，扩散距离有限等缺点，导致其在抗真菌感染中的应用受到很大限制，并且目前基于ucnps的纳米组件不能精确的报告感染部位，使得ucnps不可避免地在正常细胞或组织中积累，从而产生不可控的ros，导致严重的细胞损伤。
3、基于此，本专利技术提供了一种aptbs-mb/ucnp@cms纳米复合材料的制备方法，该纳米复合材料具有靶向性更高，稳定性更好，血液循环时间更长等优点，并且该方法操作简单，可以实现检测与治疗一体化。
4、本文中的合成ucnp纳米粒子的方法参照如下文献：张勇，黄凯，张勇，张勇，近红外光活化纳米材料的制备及其应用，自然科学进展，2016,11,688-713。
技术实现思路
1、为解决
技术介绍
中所提出的技术问题，本专利技术提供一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法和应用。
2、本专利技术采用以下技术方案实现：一种近红外响
3、本专利技术提出了一种近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
4、步骤1、细胞膜的提取：thp-1细胞经培养瓶培养到密度约80％～90％后，加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(pma)溶液继续培养一段时间，待细胞贴壁后，再次加入脂多糖(lps)溶液继续培养一段时间，待细胞出现分化后消化获得m1-thp-1细胞，将获取的m1-thp-1细胞收集在含有蛋白酶抑制剂的冰冷pbs缓冲液中，然后在冰浴中使用超声细胞破坏系统进行超声处理，再与蔗糖溶液混合，离心收集细胞膜并洗涤两次进行纯化，所用的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯溶液的浓度为100～200ng/ml，与thp-1细胞孵育24～48小时；
5、步骤2、按照文献方法合成ucnp纳米粒子，首先将步骤(1)中制备的m1-thp-1细胞膜与鼠红细胞膜按照一定比例混合得到杂交细胞膜，然后将mb与杂交细胞膜混合，掺入一定量的ucnp并在冰水浴中超声处理，然后用挤出器将所得混合物挤出聚碳酸酯膜，即得mb/ucnp@cms。同时，将等量的适配体/阻断链加入tris-hcl溶液中，90℃加热2～5min，冷却至室温。取dna溶液加入mb/ucnp@cms，室温孵育一定时间，离心后收集得到纳米复合材料aptbs-mb/ucnp@cms并在4℃下保存以备后续使用。
6、优选的，所述步骤1中，所用的lps溶液的浓度为10～20ng/ml，孵育时间为24～48小时；所述的蛋白酶抑制剂浓度为500μm～2mm；所述蔗糖溶液浓度为0.10～0.50m。
7、优选的，所述步骤2中，所述ucnp的浓度为0.5～2mg/ml,细胞膜浓度为2～10mg/ml,红细胞膜与m1-thp-1细胞膜的重量比为1:1～1:3，超声时间为2～5min,聚碳酸酯膜孔径大小依次为400和200nm，mb浓度为5～10μm,所用适配体/阻断链浓度为1～2μm,核酸与mb/ucnp@cms的孵育时间为20～30min。
8、本专利技术还提出了一种近红外响应的仿生纳米制剂在检测与杀菌中的应用，包括如下步骤：
9、步骤a、细菌和真菌的培养：白色念珠菌在无菌mrs培养基中培养12～24h，金黄色葡萄球菌(sa)和大肠杆菌(ec)在无菌lb培养基中培养12～24h，然后离心备用；
10、步骤b、白色念珠菌的检测：将不同纳米颗粒和白色念珠菌在pbs溶液中孵育一段时间，并以不加任何修饰的白色念珠菌作为对照，采用共聚焦显微镜对吸附白色念珠菌的ucnp进行成像。
11、步骤c、白色念珠菌的光动力治疗：在48孔板底部加入一定量的悬浮在无菌pbs中的白色念珠菌悬浮液，然后将aptbs-ucnp@cm、aptbs-mb/ucnp@cm等不同纳米颗粒引入孔中孵育一段时间。980nm激光照射后，在37℃恒温培养箱中再培养一段时间，然后将真菌悬浮液均匀涂布在琼脂板上，培养36～48h后通过计数菌落来测定真菌浓度。。
12、优选的，所述步骤a中，于温度37℃环境保持，然后，4000～6000rpm离心3～5min备用。
13、优选的，所述步骤b中，纳米复合材料的浓度为50～200μg/ml,孵育时间为20～30min，白色念珠菌的浓度为106～108cfu/ml。
14、优选的，所述步骤c中，所述白色念珠菌的浓度为105～106cfu/ml，白色念珠菌与纳米材料的孵育时间为20～30min，培养时间为2～3h，激光器照射功率为0.5～2w，照射时间为10～20min。
15、相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
16、1、该仿生纳米粒子不但具有纳米粒子本身的理化性能，而且由于包裹了天然的细胞膜，拥有了与靶细胞相似的生物学功能，在生理条件下具有更长的血液循环时间和更好的靶向能力，抗吞噬性能和稳定性增强。
17、2、该纳米复合材料只有在真菌细胞存在的情况下才能被激活并发出荧光，可以精确地检测白色念珠菌，然后通过pdt过程以最小的副作用消除真菌细胞，由于其可活化的行为，所制备的纳米复合材料可以保持沉默，直到它与白色念珠菌结合，这可以用于评估炎症的严重程度，以调整治疗方案。
18、3、该纳米复合材料的一个吸引人的特点是它的副作用很小，具有良好的生物相容性。
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1.一种近红外响应的仿生纳米制剂，其特征在于，包括M1-THP-1细胞模型的细胞膜、包裹在细胞膜内的纳米载体UCNPs、MB以及由DNA适配体(Apt)和阻断链(BS)组成的DNA传感元件。
2.一种如权利要求1所述的近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求1所述的一种近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所用的LPS溶液的浓度为10～20ng/mL，孵育时间为24～48小时；所述的蛋白酶抑制剂浓度为500μM～2mM；所述蔗糖溶液浓度为0.10～0.50M。
4.如权利要求1所述的一种近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述UCNP的浓度为0.5～2mg/mL，细胞膜浓度为2～10mg/mL，红细胞膜与M1-THP-1细胞膜的重量比为1:1～1:3，超声时间为2～5min,聚碳酸酯膜孔径大小依次为400和200nm，MB浓度为5～10μM,所用适配体/阻断链浓度为1～2μM,核酸与MB/UCNP@CMs的孵育时间为20～30min。
5.一种近
6.如权利要求1所述的，其特征在于，所述步骤A中，于温度37℃环境保持，然后，4000～6000rpm离心3～5min备用。
7.如权利要求1所述的，其特征在于，所述步骤B中，纳米复合材料的浓度为50～200μg/mL,孵育时间为20～30min，白色念珠菌的浓度为106～108CFU/mL。
8.如权利要求1所述的，其特征在于，所述步骤C中，所述白色念珠菌的浓度为105～106CFU/mL，白色念珠菌与纳米材料的孵育时间为20～30min，培养时间为2～3h，激光器照射功率为0.5～2W，照射时间为10～20min。
...【技术特征摘要】
1.一种近红外响应的仿生纳米制剂，其特征在于，包括m1-thp-1细胞模型的细胞膜、包裹在细胞膜内的纳米载体ucnps、mb以及由dna适配体(apt)和阻断链(bs)组成的dna传感元件。
2.一种如权利要求1所述的近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求1所述的一种近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所用的lps溶液的浓度为10～20ng/ml，孵育时间为24～48小时；所述的蛋白酶抑制剂浓度为500μm～2mm；所述蔗糖溶液浓度为0.10～0.50m。
4.如权利要求1所述的一种近红外响应的仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述ucnp的浓度为0.5～2mg/ml，细胞膜浓度为2～10mg/ml，红细胞膜与m1-thp-1细胞膜的重量比为1:1～1:3，超声时间为2～5min,聚碳酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：李超，汪丽，孙庆飞，桂悦悦，马洁桦，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：
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