【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外检测，具体涉及igf-1变体的定量检测方法。
技术介绍
1、胰岛素样生长因子i(insulin like growth factor i，igf i)又名somatomedinc，是肝脏合成并分泌到外周血中的一种分泌蛋白，其成熟蛋白由70个氨基酸组成，其中6个半胱氨酸相互形成了维持其空间结构的3对二硫键，因其结构与胰岛素类似而被命名。igf-1是一种活性蛋白多肽物质，它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物。其具有降血糖、降血脂、舒张血管、促生长、促细胞分化、创伤修复等作用。精准检测igf-1有助于疾病分析和确诊后用药指导。
2、本领域虽然公开了igf-1的变体之一igf-1lr3，但该变体是外源合成的，是由原始的70个氨基酸链在其n端额外添加了13个氨基酸，总共83个氨基酸。该igf-1变体仍对人体组织中的igf-1受体显示其原始活性。但目前极少报道发现igf-1在体内会产生变体，进而也没有意识到个别样本线性关系不好，是由于igf-1被分解成变体导致的。现有检测方法仅能检测出igf-1，不能检测出样本中含有的变体。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种胰岛素样生长因子i的变体的检测方法，进而为igf-1的疾病分析提供精细化数据，便于临床进一步诊断。
2、在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了胰岛素样生长因子i的变体的检测方法。根据本专利技
3、(1)使待测样本、igf-1内标和igf-1抗体接触，以便使得所述igf-1内标和所述待测样本中含有的待测胰岛素样生长因子i的变体分别与所述igf-1抗体进行特异性结合，获得富集了待测胰岛素样生长因子i的变体和内标igf-1的抗原抗体复合物；
4、(2)对所述抗原抗体复合物进行洗脱处理，以便将富集的待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标从igf-1抗体上洗脱下来并分离，获得含有待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标的待测溶液；
5、(3)通过maldi离子源质谱对所述待测溶液进行测定，以便检测待测样本中含有的胰岛素样生长因子i的变体的量，
6、其中，步骤(1)中所述igf-1抗体键合在epoxy磁珠上，。
7、所述胰岛素样生长因子i的变体包括具有单电荷质荷比7500-7520或双电荷质荷比3746-3766或三电荷质荷比2494-2514的des-r igf-1变体；
8、具有单电荷的质荷比7343-7363或双电荷质荷比3667-3687或三电荷质荷比2442-2462的des-rr igf-1变体。
9、目前，igf-1的临床检测方法以化学发光免疫分析技术为主，化学发光免疫分析技术通过测量与待测物特异性结合的二抗上发光物质发出的光强度来间接地实现对待测物的定量，但是该技术的稳定性受到了抗体特异性、非特性吸附、嗜异性抗体、干扰物等多种因素的干扰，导致定量结果的波动性较大。
10、化学发光法检测胰岛素样生长因子i，仅能够检测igf-1的量，不具有区分度，无法识别与igf-1具有不同氨基酸数目的变体。专利技术人利用maldi-tof ms检测胰岛素样生长因子i时，发现含有胰岛素样生长因子i的样品检测结果显示还有单电荷质荷比7500～7520和单电荷质荷比7343～7363的峰，经过进一步的实验验证，确定了这两个峰分别对应胰岛素样生长因子i的des-r igf-1变体和des-rr igf-1变体。专利技术人通过采用上述的检测方法，特别是创造性的发现进行检测时，将igf-1抗体键合在epoxy磁珠上，使得本专利技术的检测方法能够准确检测出des-r igf-1变体和des-rr igf-1变体，从而为igf-1的疾病分析提供精细化数据。同时专利技术人还发现，采用其他的磁珠键合方式，例如通过生物素-链霉亲和素系统将igf-1内标或胰岛素样生长因子i的变体键合在磁珠上，并不能同时检测des-r igf-1变体和des-rr igf-1变体两种变体，导致检测结果不准确，无法提供igf-1的疾病分析的精细化数据。
11、采用本专利技术的检测方法，不仅能够准确检测des-r igf-1变体和des-rr igf-1变体的量，同时也能检测igf-1的量，通过将检测到的igf-1、des-r igf-1变体和des-rr igf-1变体的量三者相加，获得igf-1总量，提升igf-1定量的准确度。根据医院的需求，通过提供igf-1的量或者igf-1总量或者igf-1变体的量，获得igf-1的疾病分析的精细化数据。
12、根据本专利技术的实施方案，当所述待测样本为血清或者血浆时，所述检测方法进一步包括在步骤(1)之前，利用裂解液对所述待测样本进行裂解处理，获得裂解后溶液，步骤(1)中将所述裂解后溶液、igf-1内标和igf-1抗体接触。
13、根据本专利技术的实施方案，所述裂解液包括裂解剂和第一缓冲液。
14、根据本专利技术的实施方案，所述裂解剂选自盐酸胍、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、吐温20、吐温80、3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、辛基-β-葡萄糖苷、辛基硫代葡萄糖苷、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇中的至少之一。
15、根据本专利技术的实施方案，所述第一缓冲液选自tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液。
16、根据本专利技术的实施方案，所述裂解液含有十二烷基硫酸钠和pbs缓冲液。
17、根据本专利技术的实施方案，所述裂解液为质量浓度1-5％十二烷基硫酸钠的pbs溶液；
18、根据本专利技术的实施方案，含有待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标的待测溶液通过以下步骤获得：
19、(ⅰ)使待测样本、igf-1内标和键合igf-1抗体的磁珠悬浮液在反应缓冲液中混匀并发生反应，以便使得所述待测样本中待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标与所述磁珠上键合的igf-1抗体进行特异性结合，获得富集了待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标的抗原抗体复合物磁珠；
20、(ⅱ)对所述抗原抗体复合物磁珠进行洗脱处理和磁力分离处理，以便将富集的待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标从igf-1抗体上洗脱下来并分离，获得含有待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标的待测溶液。
21、根据本专利技术的实施方案，所述epoxy磁珠的粒径为0.1μm～25μm，优选0.5μm～5μm。
22、根据本专利技术的实施方案，所述igf-1抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
23、根据本专利技术的实施方案，所述igf-1抗体的亲和力常数kd值为1×10-9-9×10-12。
24、本专利技术提供的igf-1抗体用于富集igf-1变体，能够提高检测的灵敏度。
25、根据本专利技术的实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.胰岛素样生长因子I的变体的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，当所述待测样本为血清或者血浆时，所述检测方法进一步包括在步骤(1)之前，利用裂解液对所述待测样本进行裂解处理，获得裂解后溶液，步骤(1)中将所述裂解后溶液、IGF-1内标和IGF-1抗体接触；
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，含有待测胰岛素样生长因子I的变体和IGF-1内标的待测溶液通过以下步骤获得：
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Epoxy磁珠的粒径为0.1μm～25μm，优选0.5μm～5μm；
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，所述反应缓冲液包括选自MES缓冲液、PBST缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少之一；
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)或(Ⅱ)之前，进一步包括对步骤(1)或(Ⅰ)的产物进行第一清洗和第二清洗，第一清洗采用的清洗液为含有非离子型表面活性剂的缓冲液，所述第二清洗采用去离子水；
7.根据权
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述MALDI离子源质谱为MALDI-TOFMS或者MALDI-TOF-TOF MS。
10.一种用于同时检测胰岛素样生长因子I及其变体的方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.胰岛素样生长因子i的变体的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，当所述待测样本为血清或者血浆时，所述检测方法进一步包括在步骤(1)之前，利用裂解液对所述待测样本进行裂解处理，获得裂解后溶液，步骤(1)中将所述裂解后溶液、igf-1内标和igf-1抗体接触；
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，含有待测胰岛素样生长因子i的变体和igf-1内标的待测溶液通过以下步骤获得：
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述epoxy磁珠的粒径为0.1μm～25μm，优选0.5μm～5μm；
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(ⅰ)中，所述反应缓冲液包括选自mes缓冲液、pbst缓冲液、tris-hcl缓冲液中的至少之一；
6.根据权利要求3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：马雪婷，陈宏敏，黄改荣，周晓光，李运涛，王蕾，
申请(专利权)人：融智生物科技青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：
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