【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
相关申请的交叉引用本申请基于并要求2021年5月31日提交的韩国专利申请第10-2021-0070036号的优先权，其公开通过引用整体并入本文。本专利技术涉及用于制备重配轮状病毒的方法，提供了使用抑制性rna作为重配轮状病毒的选择压力的反向遗传学平台。
技术介绍
1、轮状病毒是全球婴幼儿胃肠炎最重要的单一病因。全世界每年约有1亿5岁以下儿童患有轮状病毒胃肠炎，约有60万人死亡。死亡主要发生在发展中国家，但发展中国家和发达国家的患病率相似。因此，为了预防轮状病毒胃肠炎，降低轮状病毒感染引起的死亡率，疫苗的研制至关重要。
2、由于轮状病毒具有由11段双链rna(dsrna)的片段组成的基因组，当多个病毒株共感染一个细胞时，可以产生不同株的rna片段混合的重配病毒。例如，可以制备重配病毒，其中混合了对人类无毒的牛轮状病毒rna片段和引起人轮状病毒胃肠炎的人轮状病毒rna片段。在这些牛-人重配病毒中，其中编码对人显示毒力的vp4的重配病毒片段由来自牛轮状病毒的rna片段组成，编码vp7的重配病毒片段包含许多中和表位，由来自人轮状病毒的rna片段组成，对人无毒性，不引起胃肠炎，但它们能诱导抗人轮状病毒中和抗体的形成，因此可用作抗人轮状病毒的疫苗。一个这样的实例为其为通过对从牛和人身上分离的轮状病毒进行重配和减毒而制成的五价疫苗。
3、制备重配病毒的常见方法是同时用两种类型的轮状病毒感染一个细胞系以获得重配病毒，但可以应用反向遗传学来增加重配的可能性。反向遗传学方法包括将过量的待重配基因的mrna、或可转录成mrna
4、然而，即使使用反向遗传学增加了重配的可能性，由于重配病毒的数量非常少，并且与野生型(wt)病毒相比减弱，除非施加选择压力，否则随着传代过程的进行，比例逐渐下降，使得分离和挽救所期望的重配病毒变得非常困难。因此，必须引入适当的选择过程才能获得成功的重配轮状病毒。
5、目前在选择过程中使用的方法是使用特异性结合并中和待替换基因(例如人轮状病毒的vp7基因)的蛋白质，但不结合替换基因(例如，牛轮状病毒的vp7基因)的蛋白质的单克隆中和抗体(例如，美国专利第4,571,385号)。然而，使用单克隆中和抗体的方法需要大量的时间和成本来获得中和抗体，并且由于轮状病毒毒株由具有相似序列、功能和结构的基因组成，因此存在难以获得对特定毒株的蛋白质具有特异性的中和抗体的问题。因此，有必要研究和开发可以施加选择压力的分离技术。
技术实现思路
1、技术问题
2、本专利技术涉及用于制备重配轮状病毒的方法，提供了使用抑制性rna作为重配轮状病毒的选择压力的反向遗传学平台。
3、技术方案
4、本文所述的实施方案提供了用于制备重配轮状病毒的方法，其包括：提供细胞系，其稳定表达针对第一轮状病毒的11个基因片段中的特定基因片段的抑制性rna；将对应于第一轮状病毒特定所述基因片段的第二轮状病毒基因片段的mrna，或编码该mrna的dna或cdna引入细胞系；用第一轮状病毒感染细胞系；和回收重配轮状病毒，该重配轮状病毒包含对应于第一轮状病毒的所述特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段。
5、本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的抑制性rna寡核苷酸，其抑制选自seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5中的任何一个或多于一个靶位点。
6、本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的组合物，该组合物包含抑制选自seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5的中任何一个或多于一个靶位点的抑制性rna寡核苷酸。
7、本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的双链dna寡核苷酸，其由选自seq id no：6和seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9、以及seq idno：10和seq id no：11中的任何一个或多于一个序列对形成。
8、本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的组合物，该组合物包含由选自seq id no：6和seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9、以及seq idno：10和seq id no：11中的任何一个或多于一个序列对形成的双链dna寡核苷酸。
9、本文所述的另一实施方案提供了用于制备野生型wc3轮状病毒的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含抑制性rna寡核苷酸或双链dna寡核苷酸。
10、本文所述的另一实施方案提供了用于制备牛轮状病毒vp7蛋白质的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含抑制性rna寡核苷酸或双链dna寡核苷酸。
11、本文所述的另一实施方案提供了野生型wc3轮状病毒的生产被抑制的细胞系，其中该细胞系被引入抑制性rna寡核苷酸或双链dna寡核苷酸。
12、本文所述的另一实施方案提供了牛轮状病毒vp7蛋白质的生产被抑制的细胞系，其中该细胞系被引入抑制性rna寡核苷酸或双链dna寡核苷酸。
13、技术效果
14、由于根据本专利技术的轮状病毒重配方法使用反向遗传学方法，因此重配的概率显著高于通过同时感染两种类型的轮状病毒来获得重配病毒的传统方法。因此，预计所需时间可以大大缩短。此外，由于不使用单克隆中和抗体来选择重配病毒，因此可以减少获得单克隆中和抗体所需的成本和时间。因此，使用本专利技术，可以在比传统方法更短的时间和更低的成本下制备所期望的重配轮状病毒，并且可以用作疫苗。
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1.一种用于制备重配轮状病毒的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一轮状病毒为非人轮状病毒、牛轮状病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒、犬轮状病毒或山羊轮状病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其中第一轮状病毒为WC3轮状病毒毒株或其后代。
4.根据权利要求1所述的方法，其中第二轮状病毒是入轮状病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中第二轮状病毒是P1、P2、G1、G2、G3、G4或G9人轮状病毒血清型。
6.根据权利要求1所述的方法，其中第二轮状病毒是WI79、Wa、D、WISC2、DS-1、WI78、P、HCR3A、Br(Bricout)B、ST-3、BrB-9、WI79-9、SC2-9或WI78-8轮状病毒毒株或其后代。
7.根据权利要求1所述的方法，其中特定基因片段是编码选自VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5的蛋白质的基因片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中特定基因片段是编码VP7或VP4的基因片段。
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