【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗制备，具体涉及一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法。
技术介绍
1、鸡马立克氏病(marek’s disease，md)是由疱疹病毒科的马立克氏病毒(marek’sdisease virus，mdv)引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。md在临床上引起肿瘤和死亡的同时，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答，引发其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。
2、疫苗接种仍是目前控制马立克氏病的有效途径之一。疫苗生产的关键点就是作为抗原的病毒的生产。目前使用的商品化鸡马立克氏病疫苗大都是用原代鸡胚成纤维细胞作为制苗材料，以获得马立克氏病毒抗原。产业化生产多采用传统转瓶培养，转瓶方法在生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养转瓶的有限面积，培养的环境条件难以检测和控制，因此细胞密度低，劳动强度大，批间差异大，病毒含量不高引起质量不稳定，操作过程易污染，疫苗产量及质量受到极大限制。
3、细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养基内生长增殖的一种培养方法，细胞能达到较高密度，可用于多种产品生产。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽
4、因此，亟需一种原代细胞悬浮培养技术生产鸡马立克氏病疫苗的工艺方法。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术提供一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，包括以下步骤：
4、(1)将鸡胚消化：将10日龄鸡胚预处理后，采用以胰蛋白酶进行消化，消化结束后用缓冲生理盐水脱酶，得鸡胚消化液；
5、(2)制备细胞悬浮液：将鸡胚消化液和含5％胎牛血清的培养基置于培养瓶中，鸡胚消化液和培养基体积少于培养瓶体积的4/5，将培养瓶置于磁力搅拌器搅拌后，静置沉淀，去上清液，再对培养瓶中的沉淀加入胰蛋白酶消化多次，然后对细胞进行计数，2-8℃保存，备用；
6、(3)生物反应器培养：将步骤(2)细胞悬浮液用预热的含5％胎牛血清的培养基将细胞悬浮液稀释至细胞密度为1.0-2.0×106cells/ml，转移到生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速为50-120rpm，温度为36.5-37.5℃，ph为6.9-7.3，溶氧为30-50％，生长48-72h，至细胞密度为4-5.0×106cells/ml时；
7、(4)分离细胞：将步骤(3)的细胞通过内置过滤器或通过离心将细胞和含5％胎牛血清的培养基分离，排出含5％胎牛血清的培养基，弃去含5％胎牛血清的培养液后，在无菌条件下，加入2％胎牛血清的培养基至细胞密度为4.5-5.0×106cells/ml；
8、(5)接种病毒种：按照每升培养总量接种1500万pfu的鸡马立克氏病病毒毒种；设置搅拌转速为70-80rpm，温度为36.5-37.5℃，ph为6.9-7.3，溶氧为30-50％，继续自动培养；
9、(6)病毒收获：接毒培养36h后，观察细胞病变情况，待细胞病变达60-70％，停止培养，收获。
10、优选地，所述预处理具体步骤是：将10日龄鸡胚有空气部分朝上放置，用75％酒精棉球消毒鸡胚气室，静置待气室表面酒精干燥后，用剪刀剪去气室部位的蛋壳，撕开胚胎胎膜；用镊子夹住鸡胚头部或双腿将鸡胚挑出，移入平皿中，去除鸡胚眼睛和大脑部分，将鸡胚转移到烧杯中；用镊子搅拌以清洗鸡胚上附着的蛋黄、血水等，缓慢倒出洗液后再加入缓冲生理盐水连续清洗鸡胚2次后，用组织剪将鸡胚剪碎；再用缓冲生理盐水清洗至少2次。
11、优选地，所述胰蛋白酶是温度为36-40℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶，每枚鸡胚使用6-8ml，消化时间为12-15min，并且每隔4-5min轻柔转动1次。
12、优选地，所述缓冲生理盐水的ph为7.0-7.3，脱酶至少3次。
13、优选地，步骤(2)中，磁力搅拌时间为30-60s，上清液采用9层纱布袋过滤，再在沉淀中加入0.25％胰蛋白酶溶液，对沉淀组织继续消化和搅拌3次，搅拌时间依次为1分、2分、3分钟。
14、优选地，在步骤(3)中，细胞悬浮液的初始密度为1.0×106cells/ml、1.2×106cells/ml、1.4×106cells/ml、1.6×106cells/ml、1.8×106cells/ml的接种密度接种于细胞生物反应器中进行悬浮培养。
15、优选地，所述病毒种平均效价为420万pfu/ml。
16、优选地，所述培养基包括以下重量份数的原料：199营养液90-98份、7.5％碳酸氢钠溶液2-3份、2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基3-5份、海藻糖0.2-0.5份、半胱氨酸0.001-0.01份、精氨酸0.001-0.01份、烟酸0.001-0.01份。
17、优选地，所述培养基包括以下重量份数的原料：199营养液95份、7.5％碳酸氢钠溶液2份、2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基3份、海藻糖0.3份、半胱氨酸0.005份、精氨酸0.005份、烟酸0.005份。
18、优选地，在步骤中(3)中，加入生物反应器前用预热的培养基温度为34-38℃。
19、本专利技术的技术效果和优点：
20、(1)本专利技术对199营养液采用2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基、半胱氨酸、精氨酸和烟酸进行改良后，使得原代细胞可以在生物反应器进行悬浮细胞培养，结合生物反应器在50-120rpm转速下进行培养，降低细胞对贴壁的依赖，从而提高原代细胞悬浮生长率，使悬浮细胞能够大规模生长在生物反应器中，相对与转瓶培养和细胞工厂培养，大大降低了生产成本，并且生物反应器培养的细胞终端产品均一性、稳定性高，产品产量提高，易于规模化生产。
21、(2)本专利技术采用原代细胞培养细胞，无需进行特殊的驯化，将细胞直接在培养基中生长、增殖、分化，培养基包含细胞所需的生长和分化因子，以及适量的营养物质和金属离子，使细胞获得最自然的生长环境，实现更高效的细胞增殖和分化。
22、(3)本专利技术悬浮培养的原代鸡胚成纤维细胞接种病毒种，采用生物反应器培养大量原代细胞后，收获时能达到平均25-30万pfu/ml，所用设备占地面积小，生产规模大，批间差异小，简化下游产物的分离纯化，接种病毒的蚀斑数及表达蛋白含量高，安全性高，减少劳动本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述预处理具体步骤是：将10日龄鸡胚有空气部分朝上放置，用75％酒精棉球消毒鸡胚气室，静置待气室表面酒精干燥后，用剪刀剪去气室部位的蛋壳，撕开胚胎胎膜；用镊子夹住鸡胚头部或双腿将鸡胚挑出，移入平皿中，去除鸡胚眼睛和大脑部分，将鸡胚转移到烧杯中；用镊子搅拌以清洗鸡胚上附着的蛋黄、血水等，缓慢倒出洗液后再加入缓冲生理盐水连续清洗鸡胚2次后，用组织剪将鸡胚剪碎；再用缓冲生理盐水清洗至少2次。
3.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述胰蛋白酶是温度为36-40℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶，每枚鸡胚使用6-8ml，消化时间为12-15min，并且每隔4-5min轻柔转动1次。
4.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述缓冲生理盐水的pH为7.0-7.3，脱酶至少3次。
5.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，磁力搅拌
6.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，在步骤(3)中，细胞悬浮液的初始密度为1.0×106cells/ml、1.2×
7.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述病毒种平均效价为420万PFU/ml。
8.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述培养基包括以下重量份数的原料：199营养液90-98份、7.5％碳酸氢钠溶液2-3份、2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基3-5份、海藻糖0.2-0.5份、半胱氨酸0.001-0.01份、精氨酸0.001-0.01份、烟酸0.001-0.01份。
9.根据权利要求8所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述培养基包括以下重量份数的原料：199营养液95份、7.5％碳酸氢钠溶液2份、2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基3份、海藻糖0.3份、半胱氨酸0.005份、精氨酸0.005份、烟酸0.005份。
10.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，在步骤中(3)中，加入生物反应器前用预热的培养基温度为34-38℃。
...【技术特征摘要】
1.一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述预处理具体步骤是：将10日龄鸡胚有空气部分朝上放置，用75％酒精棉球消毒鸡胚气室，静置待气室表面酒精干燥后，用剪刀剪去气室部位的蛋壳，撕开胚胎胎膜；用镊子夹住鸡胚头部或双腿将鸡胚挑出，移入平皿中，去除鸡胚眼睛和大脑部分，将鸡胚转移到烧杯中；用镊子搅拌以清洗鸡胚上附着的蛋黄、血水等，缓慢倒出洗液后再加入缓冲生理盐水连续清洗鸡胚2次后，用组织剪将鸡胚剪碎；再用缓冲生理盐水清洗至少2次。
3.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述胰蛋白酶是温度为36-40℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶，每枚鸡胚使用6-8ml，消化时间为12-15min，并且每隔4-5min轻柔转动1次。
4.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，所述缓冲生理盐水的ph为7.0-7.3，脱酶至少3次。
5.根据权利要求1所述一种鸡马立克氏病疫苗的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，磁力搅拌时间为30-60s，上清液采用9层纱布袋过滤，再在沉淀中加入0.25％胰蛋白酶溶液，对沉淀...
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟峰，覃依依，黄庆南，杨妮，韦杰康，何丽红，戴金凤，蒋斌，陆晶莹，何东贤，雷谨畅，王成业，肖华春，
申请(专利权)人：广西丽诚东生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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