【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞外囊泡，具体涉及间充质干细胞来源的微囊泡的应用。
技术介绍
1、人口老龄化是目前大多数慢性疾病的主要危险因素之一，由此引发的与年龄相关的慢性疾病，包括心脑血管疾病、肿瘤等，是目前最主要的医疗负担。随着年龄的增加，胃肠道运动功能障碍性疾病的发病率会逐渐升高，包括胃食管反流、吞咽困难、肠易激综合征、慢性便秘、憩室病、直肠脱垂、大便失禁等，可能会导致早饱、饱腹感增加和食欲不振，从而导致体重下降，甚至营养不良、免疫功能抑制等，大大降低老年患者的生活质量。
2、研究证明胃肠道运动功能障碍性疾病的发生与肠神经系统损伤密切相关，随着年龄的增长，肠神经系统中不同类型细胞，包括神经元、胶质细胞和间质细胞等，都有不同程度的丢失，从而影响胃肠道运动功能。然而由于胃肠道运动功能调控的复杂性，衰老相关的肠神经系统损伤及退行性变引起的胃肠道运动功能障碍目前尚缺乏有效的治疗手段。
3、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是存在于多种组织器官中具有多项分化潜能的成体干细胞，因其在体外易获取、易扩增、以及独特的移植后免疫赦免特性而备受关注，已有大量研究证明间充质干细胞可促进神经损伤修复，参与脊髓损伤、帕金森病、阿尔兹海默病等多种神经损伤或神经退行性疾病的治疗过程。但是干细胞治疗本身存在很多问题，包括干细胞异常分化导致肿瘤形成、免疫排斥反应以及干细胞的长期保存与运输等，其临床应用受到限制。
4、mscs来源的细胞外囊泡可以保持干细胞的多种生物学效应，但避免了干细胞的潜在副作用，
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供间充质干细胞来源的微囊泡的应用。
2、本专利技术的目的在于提供微囊泡在制备治疗胃肠运动功能障碍性疾病的药物中的应用，尤其是在制备治疗衰老相关胃肠道运动功能障碍性疾病中的应用。
3、微囊泡(microvesicles，mvs)是一种由脂质双层分隔的颗粒，可以从多种不同类型的细胞中分泌出来，是细胞间通讯的重要介质。目前尚未有关于mscs来源的微囊泡能够治疗衰老相关的胃肠道运动功能障碍性疾病的研究。
4、根据本专利技术的具体实施方式的微囊泡的应用，所述微囊泡由间充质干细胞培养分离得到。
5、其中，间充质干细胞来源实验动物或人体，其中，实验动物包括小鼠、大鼠、兔、狗、猴等；本专利技术的间充质干细胞所用的是小鼠骨髓来源的msc，msc来源有还包括脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞等。
6、根据本专利技术具体实施方式的微囊泡应用，所述微囊泡的直径为100-1000nm，从而，其不易被肝、肺等器官截留，以发挥更持久的治疗效果。
7、根据本专利技术具体实施方式的微囊泡应用，，所述微囊泡由包括以下步骤的方法制备得到：
8、⑴将mscs在含有10％fbs低糖dmem培养基中培养，至细胞融合达60-70％后，用无菌pbs缓冲液洗涤2遍；
9、⑵将mscs在含有5％细胞外囊泡耗尽的fbs中培养；细胞外囊泡耗尽胎牛血清由超速离心后获得，120000g离心12小时，去除其含有的牛血清evs及蛋白质聚集体；
10、⑶收集培养细胞上清，并离心去除细胞成分，继续离心，沉淀杂质，得到上清液；
11、⑷将步骤⑶所得的上清，离心，即分别得到msc-mvs沉淀；用无菌pbs缓冲液重悬所述msc-mvs沉淀，离心，即得到间充质干细胞来源的微囊泡。
12、使用本专利技术的方法制备的微囊泡具有如下特征：⑴直径约为100-1000nm，具有脂质膜；(2)经蛋白分析含有cd63、cd9等蛋白分子。
13、具体的，微囊泡由包括以下步骤的方法制备得到：
14、⑴将mscs在含有10％fbs低糖dmem培养基中培养至细胞融合达60-70％，用无菌pbs缓冲液洗涤2遍；
15、⑵将mscs在含有5％细胞外囊泡耗尽的fbs中培养；细胞外囊泡耗尽胎牛血清由超速离心后获得，120000g离心12小时，去除其含有的牛血清evs及蛋白质聚集体；
16、⑶48小时后收集培养细胞上清并以600g×10min，4℃下离心去除细胞成分；所得上清以2000g×30min，4℃下离心，沉淀细胞碎片等杂质，得到上清液；
17、⑷所得上清液再以16000g×75min、4℃离心即分别得到msc-mvs沉淀；无菌pbs缓冲液重悬所得的msc-mvs沉淀，20000g×75min、4℃离心，即得到msc-mvs。
18、优选的，还包括以下步骤：
19、⑸将含有微囊泡的沉淀物悬浮在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中并立即使用，或在-80℃下储存；
20、⑹用bca蛋白质微量测定法测量微囊泡的蛋白质密度。
21、根据本专利技术具体实施方式的微囊泡的应用，胃肠运动功能障碍性疾病包括胃食管反流、肠易激综合征、慢性便秘和/或大便失禁。
22、本专利技术的目的在于提供微囊泡制备治疗衰老相关胃肠道运动功能障碍性疾病中的应用，其中，在研究微囊泡治疗效果时使用老龄小鼠作为实验对象，老龄小鼠指18-24月龄野生型c57bl/6小鼠。
23、本专利技术的目的在于提供一种促进衰老相关胃肠道运动功能恢复的药物，所述药物包括微囊泡；微囊泡的药剂量为20微克(μg)。
24、优选的，所述药物还包括磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液成分包含：2.7mm kcl，2.0mm kh2po4，137mm nacl，10mm na2hpo4。
25、本专利技术还提供验证上述药物的动物模型，所述动物模型为：选取肠神经损伤的老龄小鼠，对小鼠的腹腔注射所述药物，每周给药一次，共计给药4周；统计小鼠的排便频率、粪便含水量、胃肠道传输时间，
26、其中，排便频率：每小时计数粪便数量来评估排便频率；
27、粪便含水量％＝[(湿重(mg)-干重(mg)/湿重(mg)]×100％；
28、胃肠传输时间为管饲和第一个黑色粪便颗粒出现之间的时间段。
29、当mscs来源微囊泡干预组老龄小鼠排便频率、粪便含水量显著高于对照老龄小鼠，胃肠传输时间显著短于对照组老龄小鼠，且两者间差异有统计学意义上时(p＜0.05)，可以判定微囊泡干预有效。
30、同时，本专利技术还提供微囊泡在同时提高结肠神本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.微囊泡在制备治疗胃肠运动功能障碍性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微囊泡由间充质干细胞培养分离得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微囊泡的直径为100-1000nm。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微囊泡由包括以下步骤的方法制备得到：
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，胃肠运动功能障碍性疾病包括胃食管反流、肠易激综合征、慢性便秘和/或大便失禁。
6.微囊泡在提高结肠神经元标记物HuC的表达量中的应用。
7.微囊泡在提高胶质细胞标记物GFAP的表达量中的应用。
【技术特征摘要】
1.微囊泡在制备治疗胃肠运动功能障碍性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微囊泡由间充质干细胞培养分离得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微囊泡的直径为100-1000nm。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔺蓉，施慧英，徐时钊，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。