【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，尤其是涉及来源于嗜热产硫化氢高温厌氧杆菌(thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)的胺脱氢酶的突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该胺脱氢酶突变体或重组表达转化体作为催化剂催化中长链酮酸不对称胺化，进而制备光学活性γ/δ-内酰胺的方法。
技术介绍
1、环状内酰胺在有机化学中被广泛用作合成更复杂结构的关键中间体，也可作为天然产物或重要医药化合物的核心结构。青霉素和头孢菌素是当今使用的主要类型的β-内酰胺，其基本结构是一个四元环。γ-内酰胺，也称为2-吡咯烷酮，属于大量天然和非天然物质的核心结构，涵盖了广泛的生物活性。δ-内酰胺，又称为2-哌啶烷酮，近年来引起了广泛关注，因为这些含氮杂环化合物存在于生物活性的化合物中。
2、然而，通过从植物中提取或是通过化学法合成γ/δ-内酰胺都存在一定的缺陷，例如产量低、光学纯度差和环境污染等问题。通过动力学拆分的方式催化外消旋内酰胺虽然报道较多，但是成本高、产率低；虽然氨基酸脱氢酶大量存在、易于获得，但是使用市售的氨基酸脱氢酶还原胺化酮类底物需要借助异丙胺、丙氨酸等作为胺供体，催化效率本身并不高，并且随着反应的发生，副产物也会不断积累。基于以上原因，开发一条新颖、成本低、安全、绿色、选择性优异的内酰胺合成方法具有重要的科学和应用价值。
3、胺脱氢酶(amdh)能够利用游离氨作为胺供体，催化还原胺化酮类底物，用于合成胺。大部分报道的amdh是由氨基酸脱氢酶改造获得，关于天然存在的
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，针对目前生物催化法制备光学活性手性内酰胺技术中的胺脱氢酶天然酶活性低、选择性差的现状，通过酶蛋白的分子改造等技术手段提供一种来源于thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的催化活性高、选择性强的胺脱氢酶的突变体。本专利技术还进一步提供包含该胺脱氢酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及提供所述重组胺脱氢酶突变体在不对称转化中长链羰基酸以制备相应光学活性γ-/δ-内酰胺中的应用。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
3、本专利技术的技术方案之一：提供一种催化性能明显改善的胺脱氢酶突变体。
4、本专利技术以来自嗜热产硫化氢高温厌氧杆菌(thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)的胺脱氢酶ttheramdh为母本，通过随机突变与半理性改造，筛选到催化性能、稳定性及对映选择性均提高的突变体，其中，胺脱氢酶ttheramdh的氨基酸序列如seq id no.2所示。胺脱氢酶ttheramdh基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术中，以该胺脱氢酶基因作为母本，采用易错pcr、迭代饱和突变、dnashuffling等组合突变策略对其进行进一步定向进化，结合酶标仪高通量初筛和紫外分光光度计复筛，以5-羰基己酸作为模式底物，鉴别催化性能和对映选择性显著改善的胺脱氢酶。
6、本专利技术提供的胺脱氢酶突变体(也可以称之为胺脱氢酶ttheramdh突变体)，是将如seq id no.2所示氨基酸序列第第36位苏氨酸、第37位天冬氨酸、第41位丝氨酸、第59位苏氨酸、第119位谷氨酸、第189位谷氨酸、第191位缬氨酸、第251位甲硫氨酸、第282位酪氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，且所述衍生蛋白质具有高于seq idno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和对映选择性。
7、在本专利技术的一个实施方式中，所述胺脱氢酶突变体是选择如下的一种或多种的突变组合以后所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，且所述衍生蛋白质具有高于seq idno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和对映选择性：
8、(1)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第36位苏氨酸替换为丙氨酸；
9、(2)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第37位天冬氨酸替换为甘氨酸；
10、(3)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第41位丝氨酸替换为赖氨酸；
11、(4)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第59位苏氨酸替换为丙氨酸；
12、(5)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第119位谷氨酸替换为甘氨酸；
13、(6)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第189位谷氨酸替换为甘氨酸；
14、(7)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第191位缬氨酸替换为丙氨酸；
15、(8)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第251位甲硫氨酸替换为赖氨酸；
16、(9)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第282位酪氨酸替换为半胱氨酸。
17、在本专利技术的一个实施方式中，所述胺脱氢酶突变体的氨基酸序列选择如下中的一种：
18、(1)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第41位丝氨酸替换为赖氨酸，第189位谷氨酸替换为甘氨酸，第251位甲硫氨酸替换为赖氨酸；
19、(2)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第41位丝氨酸替换为赖氨酸；
20、(3)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第189位谷氨酸替换为甘氨酸；
21、(4)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第251位甲硫氨酸替换为赖氨酸；
22、(5)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第41位丝氨酸替换为赖氨酸，第189位谷氨酸替换为甘氨酸；
23、(6)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第41位丝氨酸替换为赖氨酸，第251位甲硫氨酸替换为赖氨酸；
24、(7)将如seq id no.2所示氨基酸序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体是选择如下的一种或多种的突变组合以后所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，且所述衍生蛋白质具有高于SEQ IDNo.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和对映选择性：
2.根据权利要求1所述胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体的氨基酸序列选择如下中的一种：
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述的胺脱氢酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求3所述分离的核酸。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，其包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种胺脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，选自以下形式中的任意一种：
7.如权利要求1或2所述的胺脱氢酶突变体或如权利要求6所述的胺脱氢酶突变体催化剂在催化中长链酮酸制备光学活性γ-/δ-内酰胺中的应用，其特征在于，所述中长链羰基酸化学结构如下所示：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在甲酸脱氢酶、甲酸和NAD+的存在下，在如权利要求1或2所述的胺脱
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，不对称还原反应结束后，通过化学法对中长链γ-/δ-羟基酸进行环化，获得相应的光学活性γ-或δ-内酰胺。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，底物在反应液中的浓度为4-8mmol/L，所述胺脱氢酶催化剂中羰基还原酶的用量为1U/L，甲酸在反应液中的浓度为3mmol/L，额外添加的NADP+的用量为0.2mmol/L；
...【技术特征摘要】
1.一种胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体是选择如下的一种或多种的突变组合以后所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，且所述衍生蛋白质具有高于seq idno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和对映选择性：
2.根据权利要求1所述胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体的氨基酸序列选择如下中的一种：
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述的胺脱氢酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求3所述分离的核酸。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，其包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种胺脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，选自以下形式中的任意一种：
7.如权利要求1或2所述的胺脱氢酶突变体或如权利要求6所述...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。