【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织工程中材料领域和细胞领域，提供一种用于3d细胞培养和微组织制备的多孔微球及其在移植治疗中应用。
技术介绍
1、随着再生医学的发展，基于多功能性细胞的细胞疗法为当前手术或药物治疗难以见效的疑难杂症或罕见病提供了新的治疗方案。而干细胞治疗已经成为当前再生医学中的研究热点。干细胞治疗中所使用的干细胞包括人多能干细胞(hpscs)，间充质干细胞(mscs)，胚胎干细胞(escs)以及诱导多能干细胞(ips)等。大量临床研究验证了mscs治疗神经退行性疾病，心血管疾病，移植物抗宿主病，创面修复以及肿瘤等疾病的安全性和有效性，但是大多数进入临床实验的mscs治疗效果难以达到主要预期效果。mscs用于临床治疗主要基于其免疫调节、组织修复、归巢性和旁分泌等特性。
2、影响mscs治疗效果的因素主要包括其归巢特性使其迁移到受损组织，以达到治疗疾病的效果，但影响mscs归巢的因素有多种，包括mscs的质量、移植时间和数量、培养方式以及mscs的移植载体及给药途径等。其中常用的mscs培养方法为2d贴壁培养，随着培养代次的增长，该培养方法会逐渐导致mscs干性逐渐降低，引起其免疫抑制能力和再生能力的下降，mscs趋化能力下降，从而影响其治疗效果。mscs移植到体内后，随着移植时间的延长，由于微环境的改变导致大量移植细胞死亡，被巨噬细胞吞噬，使得发挥治疗作用的mscs数量大大减少，从而降低其治疗效果。除此之外，mscs在移植时使用的生物材料载体种类及给药途径，都是影响mscs移植后发挥治疗功效的重要因素。
3、
4、另外，组织细胞包括上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织等，在这些组织损伤后，利用静脉输注或局部注射的方法进行细胞再生治疗过程中，仍广泛存在归巢细胞数量少，细胞体内存活率低，存活时间短，难以发挥功效等问题尚待解决。因此，制备基于可降解3d细胞培养材料和与培养细胞形成微组织材料成为研究的方向。
技术实现思路
1、基于上述背景，本专利技术的目的主要是针对当前干细胞2d培养中长时间培养引起干性降低、趋化能力下降、扩增速度不足及在治疗过程中移植后细胞存活率低和存活时间短难以发挥生物学效能的问题，提供一种可降解的多孔微球，可供细胞进行3d培养，以及与培养细胞形成微组织的方法。
2、第一方面，本专利技术提供了一种制备多孔微球的制备方法，其包括如下步骤：
3、1)制备生物高分子-粘多糖溶液作为水相，且制备含有乳化剂的有机溶液作为油相；
4、所述生物高分子-粘多糖溶液按照如下方法制备：将粘多糖溶液滴入生物高分子溶液中混匀，得到生物高分子-粘多糖溶液；其中，所述滴入时按照所述生物高分子和所述粘多糖的加入质量比为5-11：1进行；
5、上文中，所述生物高分子溶液和所述粘多糖溶液的溶剂均为乙酸水溶液；
6、具体地，所述生物高分子-粘多糖溶液按照如下方法制备：
7、1)-a、将生物高分子和粘多糖分别溶解在乙酸水溶液中，得到生物高分子溶液和粘多糖溶液；
8、1)-b、将所述粘多糖溶液滴入所述生物高分子溶液中，得到生物高分子-粘多糖溶液；
9、所述滴入时按照所述生物高分子和所述粘多糖的加入质量比为5-11：1进行；
10、上文中，在本专利技术的实施例中所述滴入时按照所述生物高分子和所述粘多糖的加入质量比为11：1。
11、所述含有乳化剂的有机溶液为将乳化剂与有机溶剂搅拌混匀，得到含有乳化剂的有机溶液；
12、2)将所述生物高分子-粘多糖溶液滴加到所述含有乳化剂的有机溶液中，搅拌混匀，得到油水混合乳液；
13、3)将所述油水混合乳液在交联剂的作用下进行交联反应，得到含有实心微球的交联反应产物；
14、4)将所述含有实心微球的交联反应产物中的微球依次进行冷冻和冻干，形成微球孔隙结构，得到多孔微球。
15、上文所述方法中，所述生物高分子为胶原、海藻酸盐、聚乳酸、聚乙烯醇、壳聚糖及其降解产物中的一种或几种组成，在本专利技术的实施例中具体为ⅰ型猪皮胶原，分子量为2000-30万kda；胶原溶液中胶原的质量体积百分含量1％(g:ml)；
16、或，所述粘多糖为硫酸角质素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素中的一种或几种组成，在本专利技术的实施例中具体为硫酸软骨素；硫酸软骨素溶液的在硫酸软骨素的质量体积百分含量1.15％(g:ml)。
17、上文所述方法中，所述胶原-粘多糖溶液中胶原的浓度为0.5％-5％(质量体积百分含量，g:ml)；
18、进一步地，所述胶原-粘多糖溶液中胶原的浓度为0.8％-1.5％；更进一步地，所述胶原-粘多糖溶液中胶原的浓度具体为1％，此配比浓度所得胶原-粘多糖粘度适当，可提高后续所制备微球的机械强度和弹性，在科研及临床操作中不易变形或破碎，具有更强的可操作性。故采用胶原-粘多糖浓度为1％。
19、上文所述方法中，所述有机溶剂为松石油醚、松节油、液体石蜡、正庚烷中的一种或几种；在本专利技术的实施例中具体为液体石蜡；
20、或，所述乳化剂为tween类表面活性剂，或span类与tween类表面活性剂组成的混合物；
21、进一步地，所述乳化剂为tween80、span80、tween 20、乳清蛋白或蔗糖脂肪酸酯中的一种或几种；在本专利技术的实施例中具体为tween-20；
22、或，所述含有乳化剂的有机溶液中乳化剂的体积百分含量为0.5％-5％，在本专利技术的实施例中具体体积百分含量为1％。
23、上文所述方法中，所述搅拌混匀的转速均为50-2000rpm；
24、进一步地，所述搅拌混匀的转速均为500-600rpm。
25、更进一步地，所述搅拌混匀的转速优选均为500rpm，转速过高易引起微球破碎，转速过低，则会造成微球沉降聚集和粘连。故选定最佳搅拌速度为500rpm；
26、或，所述搅拌混匀的时间为30min；搅拌时间低于30min，微球表面强度受力不够，易破碎，搅拌时间太长，微球表面持续受力时间长，影响微球孔隙形成。故选定最佳时间为30min；
27、或，所述搅拌混匀的温度为室温。
28、上文所述方法中，所述将胶原-粘多糖溶液滴加到所述含有乳化剂的有机溶液中采用孔内径为20-34g注射器针头逐滴滴加；
29、进一步地，所述注射器针头内径为27-30g。
30、或，所述交联剂为edta、戊二醛、乙酸酐中的一种或几种；
31、进一步地，所述交联剂为edta。
32、上文中，所述交联时间为5-60min；
33、或，所述交联剂的添加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备多孔微球的制备方法，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
4.由权利要求1-3中任一所述方法制备的多孔微球。
5.根据权利要求4所述的多孔微球，其特征在于：
6.权利要求4或5所述的多孔微球在如下任一中的应用：
7.一种细胞微组织，按照包括如下步骤的方法制备：将细胞接种在权利要求4或5所述的多孔微球上进行体外3D培养，得到细胞微组织。
8.权利要求7所述细胞微组织在制备移植治疗产品中的应用。
9.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于：所述移植治疗产品为注射用品或外敷用品；
10.根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的细胞微组织，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种制备多孔微球的制备方法，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
4.由权利要求1-3中任一所述方法制备的多孔微球。
5.根据权利要求4所述的多孔微球，其特征在于：
6.权利要求4或5所述的多孔微球在如下任一中的应用：
7.一种...
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