【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物培养，具体涉及一种快速分离被杂菌侵染的白腐菌的方法。
技术介绍
1、出于对人类经济社会可持续协调发展和环境友好型社会建设的需求，木质纤维作为一种可再生的生物质资源，因其来源丰富，生态友好而极具产能和经济价值。目前，木质纤维生物质的生物精炼存在原料利用率低，产能能耗比高等问题，主要因为木质纤维的理化性质和结构特性，在不进行脱木质素的前提下，难以达到理想的产率。白腐菌作为担子菌纲的白色丝状真菌，因其独特的生物降解酶系和强大的降解能力，是生物精炼领域极具应用潜力的微生物之一。白腐真菌可通过菌丝体侵入木质，利用木质素作为碳源并释放锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶等蛋白质酶，在打破木质纤维中天然屏障的同时释放纤维素、半纤维素和果胶等多糖，从而将木质纤维中主要成分完全降解为co2和h2o，以达到生物质能高效高值化应用。此外，白腐真菌作为一种常见的、分布广泛的食用菌，包括侧耳、香菇、杂色云芝等200多个品种，也具有极高的食用价值和药用价值。
2、白腐真菌在菌种传代保藏、接种及培养过程中，易因为母种染菌、培养物料和容器灭菌效果不达标、接种操作不当、接种环境污染等原因造成杂菌污染。杂菌与白腐真菌进行营养竞争并分泌有害物质，竞争性杀伤白腐真菌菌丝，影响目标菌种生长情况和目的产物产量。白腐真菌生产和应用中，最常见的侵染杂菌主要是木霉、青霉、曲霉、毛霉等霉菌。
3、目前，针对杂菌侵染后的菌株，特别是用于各类生产中的母种和原种菌株，最有效的方法是通过添加抗生素、抑制剂等外源添加剂进行纯化。但是，抗生素和农药
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术的目的是提供一种快速分离被杂菌侵染的白腐菌的方法，其通过将被侵染的白腐菌接种于选择培养基，通过对培养基的氮源、碳源、无机盐和维生素等成分进行营养限制，抑制木霉等杂菌生长并利于目标菌种生长，并将纯化后白腐菌菌体经过鉴定培养和扩繁培养，从而达到在较短时间内纯培养白腐菌的目的。该方法操作简单易行，可以快速将白腐菌与侵染菌株分离，成功率高，极大提升分离纯化效率。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案依次包括以下步骤：
3、一种快速分离被杂菌侵染的白腐菌的方法，依次包括以下步骤：
4、(1)孢子液制备：无菌条件下取被侵染的白腐菌表面的新鲜孢子，置于无菌水中，振荡混匀；
5、(2)分离纯化培养：将步骤(1)得到的孢子液接种于选择培养基中避光恒温培养，直至培养基表面出现菌丝。
6、所述的方法，
7、步骤(2)所用的选择培养基的组分包括：mgso4·7h2o 0.5-0.55g，cacl20.1-0.2mg，feso4·7h2o 0.4-0.5mg，znso4·7h2o 1.4-1.5mg，na2hpo4·2h2o0.12-0.13g，kh2po40.51-0.52g，cuso4·5h2o 0.17-0.18mg，c4h4o6k2 0.1-0.15g，葡萄糖1-1.2g，vb1 0.1-0.2mg，琼脂20-21g，纯水1000ml。
8、所述的方法，
9、步骤(2)在29℃-31℃条件下，放入恒温培养箱内避光培养，直至培养基表面出现菌丝。
10、所述的方法，
11、将步骤(2)获得的菌丝进行鉴定培养：挑取步骤(2)纯化培养后的菌丝划线接种于愈创木酚-pda培养基中。
12、所述的方法，
13、所述的愈创木酚-pda培养基包括：葡萄糖马铃薯琼脂培养基46-46.1g，愈创木酚0.3-1ml，纯水1000ml。
14、所述的方法，挑取步骤(2)培养后的菌丝接种到含有愈创木酚的鉴定培养基，29-31℃培养3-10天后，观察愈创木酚-pda平板，确定菌落生长情况，菌落均一，并针对菌株的菌丝和孢子形态进行镜检确定是白腐菌；若不符合白腐菌菌落特征，则重复步骤(1)和(2)的操作，再次进行分离纯化培养。
15、所述的方法，含有愈创木酚的鉴定培养基上符合白腐菌菌落特征表现为：菌落表面菌丝呈丝状或絮状气生菌丝，颜色为浓白色，菌落周围形成棕红色显色圈。
16、所述的方法，镜检方法为：用无菌接种环挑取少量菌丝体，置于滴有一滴纯净水的载玻片上，并使用1％的美蓝染液进行染色，盖上盖玻片后放于显微镜下进行观察；显微镜镜检下白腐菌的显微特征为：菌种具有发达的菌丝体，且多为多核、少隔膜、无锁状联合。
17、所述的方法，将经过愈创木酚-pda培养基鉴定后的菌株扩繁培养：挑取鉴定培养后显色圈明显的单菌落，划块接种于pda培养基中静置培养；观察萌发菌丝是否带有杂菌，没有即纯化成功。
18、所述的方法，将经过鉴定的白腐菌接种于pda培养基中，在29℃-31℃条件下培养5-7天进行扩繁；pda培养基的组分包括葡萄糖马铃薯琼脂培养基46-46.1g，纯水1000ml。
19、与现有技术相比，本专利技术具有的优势如下：
20、(1)与传统稀释法和平板划线相比，本专利技术采用分离纯化培养、鉴定培养和扩繁培养三步培养，实施案例中皆一轮培养即可成功分离纯化白腐真菌，无需进行多次反复梯度稀释菌悬液及划线分离，避免因确定菌悬液稀释浓度和平板划线等措施而重复耗费人力物力，耗时短，操作简单易行，可较大程度提高菌种纯化效率。
21、(2)与添加抗生素或其他微生物抑制剂相比，该方法通过对被杂菌侵染的白腐菌进行限制性培养，避免杂菌生长的同时，筛选出高活性的白腐菌菌株，并极大降低抗菌素耐药性以及目标菌种活性抑制等潜在风险，便于维持目标菌种性状稳定性。
22、(3)本方法在选择培养后，对目标菌种单菌落进行鉴定培养，避免了菌株不纯的可能性，便于后续纯培养。此外，通过愈创木酚法和显微镜检验两步骤，从菌落形态特征、愈创木酚-pda培养基显色情况及微观形态学等方面综合鉴定，在保证菌种提取准确性的前提下，鉴定所需的试剂及器材容易获取，方法简单有效，降低了鉴定所需技术和设施设备要求。
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1.一种快速分离被杂菌侵染的白腐菌的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取步骤(2)培养后的菌丝接种到含有愈创木酚的鉴定培养基，29-31℃培养3-10天后，观察愈创木酚-PDA平板，确定菌落生长情况，菌落均一，并针对菌株的菌丝和孢子形态进行镜检确定是白腐菌；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有愈创木酚的鉴定培养基上符合白腐菌菌落特征表现为：菌落表面菌丝呈丝状或絮状气生菌丝，颜色为浓白色，菌落周围形成棕红色显色圈。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，镜检方法为：用无菌接种环挑取少量菌丝体，置于滴有一滴纯净水的载玻片上，并使用1％的美蓝染液进行染色，盖上盖玻片后放于显微镜下进行观察；显微镜镜检下白腐菌的显微特征为：菌种具有发达的菌丝体，且多为多核、少隔膜、无锁状
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将经过鉴定的白腐菌接种于PDA培养基中，在29℃-31℃条件下培养5-7天进行扩繁；PDA培养基的组分包括葡萄糖马铃薯琼脂培养基46-46.1g，纯水1000mL。
...【技术特征摘要】
1.一种快速分离被杂菌侵染的白腐菌的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取步骤(2)培养后的菌丝接种到含有愈创木酚的鉴定培养基，29-31℃培养3-10天后，观察愈创木酚-pda平板，确定菌落生长情况，菌落均一，并针对菌株的菌丝和孢子形态进行镜检确定是白腐菌；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有愈创木酚的鉴定培养基上符合白腐菌菌落特征表...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾柏全，郑佳慧，郭泽潘，闫文徳，李美群，张轩，贾晓江，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：
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