【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物医药，特别涉及一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原及其制备方法和在制备预防rsv感染的疫苗中的应用。
技术介绍
1、呼吸道病毒感染是全球最重要的公共卫生负担之一，每年导致全世界数百万人住院治疗。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，rsv）是2岁以下儿童和65岁以上成人急性下呼吸道感染的主要原因。尽管rsv感染引起的呼吸道疾病危害严重，但目前尚无几种专门针对rsv的有效治疗方法和预防性疫苗。纵观全球进入临床阶段的rsv疫苗，研发的主要方向集中在减毒活疫苗、重组亚单位疫苗和病毒载体疫苗。rsv疫苗开发主要针对3种目标人群，包括婴幼儿、孕妇和老年人（≥60岁）。年龄小于6个月的婴儿，主要通过mabs实现被动免疫保护，或由孕妇接种rsv疫苗后经胎盘转移抗体来获得被动保护；对于年龄大于6个月的婴幼儿则可以通过主动免疫rsv减毒活疫苗来获得保护；针对孕妇和老年人，rsv疫苗的开发以亚单位疫苗为主。
2、主流疫苗抗原的选择主要集中在f蛋白，尤其是融合前构象的f蛋白（pref）。融合前构象的f蛋白相比融合后构象的f蛋白可以暴露更多具有中和活性的潜在表位，如仅在pref中存在的表位φ和表位v。针对表位φ和表位v产生的抗体具有优秀的中和活性，与融合前构象的f蛋白结合后，可以阻断通过f蛋白构象变化介导的病毒膜融合。尽管已有大量关于rsv f蛋白融合前构象稳定性的研究，但其作为疫苗使用的安全性和有效性仍面临巨大的挑战。
3、因此，提供一种安全性高且具有增强的免疫原性和改善的稳定性的rs
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种重组呼吸道合胞病毒（rsv）颗粒抗原，包含可自组装成七聚体的颗粒化结构域和rsv f蛋白重组的头部结构域，其中所述重组的头部结构域从n端至c端包含直接相连或通过接头序列连接的rsv f蛋白的f1域截短片段和f2域截短片段。
2、所述重组的头部结构域包含只存在于融合前构象中的表位，所述表位包含以seqid no: 1所示的野生型rsv f蛋白序列的残基62-69和196-209。
3、在一些实施方式中，所述颗粒化结构域位于所述重组的头部结构域的c端，与重组头部结构域的c端直接相连或通过接头序列相连。
4、在一些实施方式中，可选地，所述接头序列为gggssgs、gsgsg或g与s组成的4-10个氨基酸序列。
5、在一些实施方式中，所述颗粒化结构域可自组装成七聚体，优选地，所述颗粒化结构域为imx313。
6、“imx313”通常被认为是分子佐剂，该技术基于鸡补体抑制剂c4b结合蛋白（c4bp）的寡聚结构域的嵌合版本，以获得pfs25的均质自组装寡聚物。当在大肠杆菌中表达时，该c4 bp寡聚结构域已被证明自发形成可溶性七聚结构，这些结构域融合的蛋白抗原可改善抗体反应。
7、成熟f糖蛋白具有三个一般结构域：胞外结构域(ed)、跨膜结构域(tm)和胞质尾区(ct)。ct含有单一棕榈酰基化半胱氨酸残基。
8、人rsv的f糖蛋白首先从mrna翻译为单一574个氨基酸的多肽前体(称为“f0”或“f0前体”)，其含有n-末端的信号肽序列(氨基酸1-25)。翻译后，在内质网中通过信号肽酶移除信号肽。f0前体的剩余部分(即，残基26-574)可通过细胞蛋白酶(尤其弗林蛋白酶)在两个多基础位点(a.a. 109/110和136/137)进一步切割，移除名为pep27的27个氨基酸的间插序列（氨基酸110-136）且生成名为f1（c-末端部分，氨基酸137-574）和f2（n-末端部分，氨基酸26-109）的连接的片段。f1含有其n-末端的疏水融合肽和两个七肽重复区（hra和hrb）。hra靠近融合肽，且hrb靠近tm结构域。f1和f2片段通过两个天然二硫键连接在一起。无信号肽序列的未切割的f0蛋白或f1-f2异二聚体可形成rsv f原体。3个此类原体组装以形成最终rsv f蛋白复合物，其为3个原体的同三聚体。
9、在一些实施方式中，本专利技术所述f2域包含与seq id no:1的氨基酸26-105对应的rsv f蛋白多肽，所述f1域包含与seq id no:1的氨基酸137-516对应的rsv f蛋白多肽。
10、在一些实施方式中，所述f1域截短片段至少包含对应于野生型rsv f蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述f2域截短片段至少包含对应于野生型rsv f蛋白的第51-104位氨基酸残基。
11、在一些实施方式中，所述f1域截短片段为对应于野生型rsv f蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述f2域截短片段为对应于野生型rsv f蛋白的第51-104位氨基酸残基。
12、在一些实施方式中，可选地，所述接头序列为gggssgs、gsgsg、ggpg或g与s组成的4-10个氨基酸序列。
13、在一些实施方式中，优选地，所述接头序列为ggpg。
14、在一些实施方式中，所述重组的头部结构域进一步包含一种或多种氨基酸突变，所述氨基酸突变包括一个或多个氨基酸的添加、缺失或替换。
15、在一些实施方式中，所述氨基酸突变包括添加非天然二硫键突变和空腔填充突变。
16、在一些实施方式中，所述添加非天然二硫键突变包括通过成对的半胱氨酸取代形成人工的链内二硫键和/或链间二硫键。
17、链间二硫键（s-s）通常是指两个不同的有机分子中的硫原子之间的键。
18、链内二硫键（s-s）是指有机分子中两个相邻硫原子之间的键。
19、在本专利技术中，连接单个结构域中两个β-折叠的二硫键成为链内二硫键；连接两个不同结构域（例如，连接一个f1域和一个f2域）或连接两个相邻的相同结构域（例如，连接相邻的两个f蛋白单体的f1域）的二硫键称为链间二硫键。
20、在一些实施方式中，所述非天然二硫键突变选自v164c+k293c、g151c+i288c、h159c+i291c、s55c+l188c、s56c+v187c、s59c+v193c、k75c+e218c、t397c+e487c、s443c+s466c、t323c+i475c、i332c+p480c、s146c+n460c、i148c+y286c、a149c+y458c和s150c+q302c中至少一组。
21、在一些实施方式中，所述非天然二硫键突变选自s55c+l188c、i148c+y286c和h159c+i291c中至少一组。
22、在一些实施方式中，所述非天然二硫键突变是s55c+l188c、i148c+y286c和h159c+i291c的组合。
23、在一些实施方式中，所述空腔填充突变包括v296f、n67f、l158f、v154l、v154i、v187f、s190v、v192m、l193h、s190f、v207本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原，包含RSV F蛋白重组的头部结构域和可自组装成七聚体的颗粒化结构域，其中所述重组的头部结构域从N端至C端包含直接相连或通过接头序列连接的RSV F蛋白的F1域截短片段和F2域截短片段。
2.如权利要求1所述的颗粒抗原，其中所述重组的头部结构域的C端与所述颗粒化结构域的N端直接相连或通过接头序列相连。
3.如权利要求2所述的颗粒抗原，其中所述颗粒化结构域为IMX313。
4.如权利要求1所述的颗粒抗原，其中所述F1域截短片段至少包含对应于SEQ ID NO:1所示野生型RSV F蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述F2域截短片段至少包含对应于SEQID NO: 1所示野生型RSV F蛋白的第51-104位氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的颗粒抗原，其中所述F1域截短片段为对应于SEQ ID NO: 1所示野生型RSV F蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述F2域截短片段为对应于SEQ ID NO: 1所示野生型RSV F蛋白的第51-104位氨基酸残基。
6.如权利要求1所述的
7.如权利要求6所述的颗粒抗原，其中所述氨基酸突变包括添加非天然二硫键突变和空腔填充突变。
8.如权利要求7所述的颗粒抗原，其中所述非天然二硫键突变选自S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C中至少一组。
9.如权利要求8所述的颗粒抗原，其中所述非天然二硫键突变是S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C的组合。
10.如权利要求7所述的颗粒抗原，其中所述空腔填充突变选自N67F、S190V和V296F中的至少两种。
11.如权利要求10所述的颗粒抗原，其中所述空腔填充突变为N67F和S190V的组合。
12.如权利要求10所述的颗粒抗原，其中所述空腔填充突变为N67F、S190V和V296F的组合。
13.如权利要求7所述的颗粒抗原，其中所述氨基酸突变进一步包括静电突变。
14.如权利要求13所述的颗粒抗原，其中所述静电突变为G184N。
15.权利要求1-14中任一项所述的颗粒抗原将融合前构象的F蛋白多肽展示于七聚体纳米颗粒的表面。
16.权利要求1-14中任一项所述的颗粒抗原在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
17.一种预防RSV感染的疫苗，包含权利要求1-14中任一项的颗粒抗原；所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
...【技术特征摘要】
1.一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原，包含rsv f蛋白重组的头部结构域和可自组装成七聚体的颗粒化结构域，其中所述重组的头部结构域从n端至c端包含直接相连或通过接头序列连接的rsv f蛋白的f1域截短片段和f2域截短片段。
2.如权利要求1所述的颗粒抗原，其中所述重组的头部结构域的c端与所述颗粒化结构域的n端直接相连或通过接头序列相连。
3.如权利要求2所述的颗粒抗原，其中所述颗粒化结构域为imx313。
4.如权利要求1所述的颗粒抗原，其中所述f1域截短片段至少包含对应于seq id no:1所示野生型rsv f蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述f2域截短片段至少包含对应于seqid no: 1所示野生型rsv f蛋白的第51-104位氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的颗粒抗原，其中所述f1域截短片段为对应于seq id no: 1所示野生型rsv f蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述f2域截短片段为对应于seq id no: 1所示野生型rsv f蛋白的第51-104位氨基酸残基。
6.如权利要求1所述的颗粒抗原，其中所述重组的头部结构域进一步包含一种或多种氨基酸突变。
7.如权利要求6所述的颗粒抗原，其中所述氨基酸突变包括添加非天然二硫键突变和空腔填充...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓家荔，李菡，胡颖嵩，徐洋瑞，张元杰，杨爽，杨克俭，洪坤学，刘勇，
申请(专利权)人：北京安百胜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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