协同降解石油的复合菌液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种协同降解石油的复合菌液及其制备方法。该复合菌液由两株食烷菌９７ＣＯ－５、９７ＣＯ－６和一株海杆菌ＰＹ９７Ｓ的发酵培养液混合而成，细胞浓度均为１０７～１０９ＣＦＵ／ｍＬ。制备方法是将食烷菌和海杆菌的种子液分别以５％的接种量接入Ｍ８培养基或乙酸钠培养基，在２５℃、通气量０．２５ｍ３／ｈ、搅拌速度１５０ｒｐｍ、流加消泡剂消泡的条件下发酵培养，再将各发酵培养液混合即制得复合菌液，再离心制成５倍浓缩液后于４℃保藏。该复合菌液适合于较低环境温度的石油污染生物降解，对石油中烷烃组分和芳香烃组分的降解更充分，比单一降解菌的菌液具有更高的石油降解率，具有明显的协同降解效应。本发明专利技术的复合菌液应用于对海洋溢油污染的海岸线或滩涂的生物修复。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于污染海洋环境生物修复
，具体涉及基于海洋“专性解烃 M" (the obligatehydrocarbonoclastic bacteria, OHCB) ^|1]^Μ ^kMWΨM^n 菌液及其制备方法。
技术介绍
海洋溢油的频繁发生不仅给海洋养殖业、旅游业等造成巨大的经济损失，还会对 海洋生态环境及人类健康造成长远的负面影响。因此，如何消除海洋溢油污染、修复受损海 洋生态环境成为海洋环境保护的重要内容之一。生物修复技术由于具有成本低、较彻底、无 二次污染等优点，逐渐成为处理溢油的一种有效途径。海洋专性解烃菌是一类溢油发生前在海洋环境中丰度很低甚至低于检测限， 溢油发生后可以迅速增殖并以石油组分为唯一碳源和能源的微生物。它们当中包括 Alcanivorax (食烧菌属)、Cycloclasticus (解环菌属)、Marinobacter (海杆菌属)、 Marinobacterium(海细菌属)、Neptunomonas、Oleispira(油螺方宠菌属)、Thalassolituus 等属的细菌。20世纪90年代兴起的溢油原位生物修复技术，正是通过添加海水中缺乏的 氮、磷元素刺激这类细菌的生长、加快石油降解速率来实现的。由于这类细菌在溢油去除过 程中作用显著，并且具有迥异于陆源耐盐降解菌的生长特性、难以获得纯培养，所以它们是 一种重要的、相对稀缺的海洋菌种资源。但是采用单独一种专性解烃菌往往存在石油降解 速率低、修复效果差的问题。在溢油这种成分极其复杂的有机污染物降解过程中，在不同降解菌之间存在着各 种复杂的关系，降解菌之间的协同效应是彻底降解溢油污染物的必然方式。因此，如何充分 利用海洋专性解烃菌之间的协同效应、制备复合菌液对海洋溢油进行生物修复，已成为海 洋溢油生物修复技术研究的难点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，即利用微生物 之间在石油降解过程中的协同效应，用3株每洋专性解烃菌制备降解石油的复合菌液，以 高效快速的对海洋岸滩溢油污染环境进行生物修复。本专利技术涉及的复合菌液的菌种为2个种、3株海洋专性解烃菌，其中1种(2株)是 食烷菌(Alcanivoraxsp.)，另外1种(1株)是海杆菌(Marinobacter sp.)；上述3株细菌 已分别于2009年8月20日、2010年4月16日保藏至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号 分别为 CGMCC No. 3735 (菌株Alcanivorax sp. 97C0-5)、CGMCC No. 3736 (菌株Alcanivorax sp. 97C0-6)、CGMCC No. 3244 (菌株 Marinobacter sp. PY97S)，其纯培养的主要特征如下(1)菌株PY97S能够降解包括萘、2-甲基萘、2，-二甲基萘、联苯、苊、芴、菲、蒽、二 苯并呋喃、二苯并噻吩、苯并芘在内的至少11种PAHs。采用GC-MS测定了菌株PY97S 对典型PAHs菲的降解率，发现它对初始浓度为0. 2g/L的菲在IOd后的降解率可达到99%。3(2)菌株97C0-5、97C0_6均能够以原油或柴油为唯一碳源和能源生长，并且都能 够将含有原油的培养基的表面张力从58mN/m降低至28 30mN/m，说明这些菌株可以产生 生物表面活性剂以提高传质速率，加快石油降解过程。本专利技术的技术方案为1、协同降解石油的复合菌液(1)本专利技术的复合菌液是由食烷菌97C0-5、食烷菌97C0-6和海杆菌PY97S的发酵 培养液组成将对数生长后期(0D·分别为0. 5 1. 5，细胞密度为IO8 109CFU/mL)的3 株海洋专性解烃菌(97C0-5、97C0-6、PY97S)的发酵培养液均勻混合制成复合菌液；(2)本专利技术的复合菌液中3株菌的细胞浓度均为IO7 109CFU/mL。2、食烷菌97C0-5、食烷菌97C0-6和海杆菌PY97S的发酵培养液制备步骤如下(1)制备种子液将超低温(-80°C )保藏的菌种分别接入50mL IOL的M8培养 基或乙酸钠培养基，在18 35°C、50 200rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，分别制 备三种种子液；(2)发酵培养液制备将上述的种子液按照 10%的接种量分别接入15L 500L的M8培养基或乙酸钠培养基，发酵条件为发酵温度控制在18 35°C、通气量控制在 0. 10 0. 50m3/h、桨叶搅拌速度控制在50rpm 300rpm、在消泡电极的控制下自动流加消 泡剂进行消泡；培养到各自细胞密度为IO8 109CFU/mL时停止发酵，即制得各发酵培养液； 最后将发酵培养液混合制得复合菌液。3、制得的复合菌液通过大容量低温离心机进行3 10倍浓缩，将复合菌液或浓缩 液置于4°C保藏。其中，M8培养基每升含 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 · 6H20，3. 98g Na2SO4,1. 46g CaCl2 · 2H20,1. 30gTAPS0，0. 72g KCl，0. 27g NH4Cl,89. OOmg Na2HPO4 · 7H20，83. OOmg NaBr， 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmgH3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF, 2. OOmg FeCl2 · 4H20，2g 乙酸钠，0. 5g蛋白胨，0. 5g酵母提取物，0. 5g马铃薯浸出粉，0. 2g葡萄糖，0. 2g蔗糖，0. 05g 苹果酸钠，0. 05g柠檬酸三钠，0. 05g酒石酸钾钠，pH7. 8 ；用于菌株97C0-5、97C0_6的培养；乙酸钠培养基每升含 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 · 6H20，3. 98g Na2SO4,1. 46g CaCl2 · 2H20,1. 30gTAPS0，0. 72g KCl，0. 27g NH4Cl,89. OOmg Na2HPO4 · 7H20，83. OOmg NaBr， 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmgH3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF, 2. OOmg FeCl2 · 4H20，2g 乙酸钠，PH7. 6 ；用于菌株PY97S的培养。本专利技术的复合菌液适合于较低环境温度的石油污染生物降解，并且其降解速率较 快，在2周后即可降解82%初始浓度为10g/L的原油；该复合菌液比单一降解菌菌液具有 更高的石油降解率，对石油中烷烃组分和芳香烃组分(包括高分子量芳香烃)的降解更充 分。附图说明图1为本专利技术以重量法测定石油降解率比较示意图。图2为本专利技术以生物降解后石油中的部分烷烃组分的半定量结果比较示意图(相 对于氘代正二十四烷)。图3为本专利技术以生物降解后石油中的部分芳香烃组分的相对含量结果比较示意4图(相对于氘代三联苯)。其中NC，不接种的阴性对照处理；PY97S、97C0-5、97C0_6，分别为单一菌株培养 液；图2中的nC18 nC31是不同碳链长度的正构烷烃；Py，植烷。图3中的C0-N，萘；C0-P，菲；C0-D，二苯并噻吩；C1-N C4-N，取代基为1 4个 碳原子直链烷烃的萘；C1-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种协同降解石油的复合菌液，其特征在于该复合菌液由食烷菌９７ＣＯ－５、食烷菌９７ＣＯ－６和海杆菌ＰＹ９７Ｓ的发酵培养液组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑立，崔志松，陈宇，高伟，王绍良，李倩，吴亮，朱生凤，王东，王胜，周文俊，
申请(专利权)人：国家海洋局第一海洋研究所，中海石油环保服务天津有限公司，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]