【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农残检测，具体涉及一种基于生物传感器的啶虫脒检测方法、检测试剂盒及应用。
技术介绍
1、为提高农业生产力，实现粮食需求，在现代农业发展中，农药被广泛用于控制病虫害，提高粮食产量。但农药的过量和不当的使用，又会导致粮食、农产品或食品中农药残留严重，由于农药本身具有高毒性，残留的农药不仅会危害人类健康，还会造成生态环境破坏，导致鱼、虾、蚕等其产量下降。因此，对环境和食品中的农药残留进行检测，有助于保护环境和监控粮食安全隐患。探索高效、灵敏、快速的农药残留检测策略在农业安全和环境监测中具有重要意义，对生态环境以及生物健康发展至关重要。
2、传统的农残检测方法主要有高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc)、流动注射光谱法等，虽然这些方法已广泛应用于农药残留的检测，但这些方法往往需要大型仪器，成本高，耗时长，且需要专门的研究人员进行分析，这会对食物中农药监控造成不便影响，为解决这些问题，亟需开发快速可靠的新型检测技术，实现高效、灵敏、低成本农药定性定量检测。近年来，基于荧光、比色和电化学等技术的农残传感方法受到了广泛关注，并逐渐替代传统检测方法，因为这些方法具有快速响应、方便操作、易于携带、性能稳定等优点，有望实现现场即时的农药残留分析。其中，电化学方法由于不受样品背景颜色和荧光的干扰，在农残检测中具有广阔应用前景。通过电极表面功能化特异性识别探针，结合信号分子标记，可以实现不同基质中(如：土壤、水、水果和蔬菜等)的农残定性、定量检测。
技术实现思路
1、针对
2、为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，包含如下组分：
4、dna1/aptamer双链，dna环探针，lig传感电极；
5、其中，所述dna1/aptamer双链是dna1与啶虫脒的核酸适配体aptamer杂交成的双链，在有啶虫脒存在时，核酸适配体与啶虫脒特异性识别，并释放出dna1；所述啶虫脒的核酸适配体为单链dna或rna；
6、所述dna环探针是能与游离的dna1杂交，并在t4 dna连接酶的作用下成闭环的核酸结构，该闭环结构在phi29 dna聚合酶作用下能进行rca扩增出多个发卡结构的单链dna；
7、所述lig传感电极为对电极、参比电极和工作电极组成的三电极体系，其中工作电极为金电极，其表面连接有dna2；所述的dna2能与rca扩增出的发卡结构的单链dna杂交形成双链区域，该双链区域在静电吸附和嵌入作用下能与亚甲基蓝分子结合。
8、在一个具体的实施例中，所述啶虫脒的核酸适配体aptamer的核酸序列如seq idno:1所示。
9、在一个具体的实施例中，所述dna1的核酸序列如seq id no:2所示；所述dna环探针的核酸序列如seq id no:3所示；所述dna2的核酸序列如seq id no:4所示。
10、在一个具体的实施例中，所述lig传感电极由以下方法制备而成：
11、利用corel draw软件设计出三电极形状，在pi膜表面以3.2w的功率激光诱导技术雕刻出电极形状，随后利用电化学工作站在2mm氯金酸和0.1m kno3溶液中在工作电极表面电沉积金，随后在金电极表面滴加10μl 10μm dna2室温反应过夜后，超纯水冲洗，干燥，即得。
12、上述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，还可以包括t4 dna连接酶、t4 dna连接酶buffer、phi29 dna聚合酶、phi29 dna聚合酶buffer、dntps、bsa溶液和超纯水中的至少一种。
13、上述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒在啶虫脒检测中的应用。
14、一种检测啶虫脒的方法，使用上述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒。
15、在一个具体的实施例中，所述检测啶虫脒的方法，步骤如下：
16、(1)取dna环探针、t4 dna连接酶、t4 dna连接酶buffer和超纯水混合均匀，即得dna环探针溶液；
17、(2)取dna1/aptamer双链、超纯水和待测样品混合均匀，在37℃下反应1h后，加入上述步骤(1)制备的dna环探针溶液、phi29 dna聚合酶、phi29 dna聚合酶buffer、dntps、bsa溶液和超纯水，混合均匀，在30℃下反应5h后，65℃水浴10min结束反应，即得rca扩增反应液；
18、(3)向lig传感电极的工作电极上加入上述步骤(2)获得的rca扩增反应液，37℃反应2h，冲洗，干燥；
19、(4)取亚甲基蓝溶液滴加在上述步骤(3)处理后的lig工作电极表面室温下孵育30min后，用超纯水冲洗30s；
20、(5)在50mm tris-hcl缓冲液(ph 7.4)中，利用autolab电化学工作站采用差示脉冲伏安法对步骤(4)处理后的lig电极进行-0.8～0.2v电压下的电流测量；
21、(6)将步骤(5)测得的dpv峰电流对照dpv峰电流值-啶虫脒浓度对数的标准曲线，计算获得待测样品中啶虫脒浓度。
22、在一个具体的实施例中，所述步骤(4)中的亚甲基蓝溶液由以下方法制得：
23、取0.037g亚甲基蓝和0.015g氯化钾溶于10ml 20mm tris-hcl缓冲液中，混合均匀，即得。
24、在一个具体的实施例中，所述步骤(6)中dpv峰电流值-啶虫脒浓度对数的标准曲线由以下方法制得：
25、制备不同浓度梯度的啶虫脒标准溶液，浓度分别为0,5,50,200,1000,5000ng/ml；将不同浓度梯度的啶虫脒标准溶液按照上述步骤(1)～(5)的方式检测，获得不同浓度梯度的啶虫脒标准溶液的dpv峰电流，以dpv峰电流值为纵坐标，啶虫脒浓度的对数为横坐标，作图，即得dpv峰电流值-啶虫脒浓度对数的标准曲线。
26、上述方法可以用于检测土壤、水、水果和蔬菜等不同基质中的啶虫脒；当检测样品基质为土壤样品时，利用振荡漂洗法，将待测样品浸泡在可溶试剂中，加以振荡加速提取，获得提取液用于检测。当检测基质为水果和蔬菜时，样品首先被切碎，随后在烧杯中将样品和提取剂混合，猛烈搅拌后，以高速离心，滤取上清液，用于检测。
27、本专利技术技术方案的优点：
28、本专利技术以啶虫脒为目标物，通过制备lig传感电极，结合核酸适配体和dna滚环扩增策略，提高对啶虫脒的特异性识别和信号扩增。具体如下：适配体是单链dna或rna，可以特异性结合响应的靶标。本专利技术利用适配体特异性识别啶虫脒农药，释放引物链结合dna环探针进行滚环扩增，并进一步集成在柔性lig电极表面，亚甲基蓝(mb)通过静电吸附和嵌插与dna双链结合，进而固定在电极表面。mb作为一种电活性分子，通过检测其电化学信号，实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，包含如下组分：
2.根据权利要求1所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述啶虫脒的核酸适配体Aptamer的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述DNA1的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述DNA环探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述DNA2的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述LIG传感电极由以下方法制备而成：
5.根据权利要求1-4任一项所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶buffer、Phi29 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶buffer、dNTPs、BSA溶液和超纯水中的至少一种。
6.权利要求5所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒在啶虫脒检测中的应用。
7.一种检测啶虫脒的方法，其特征在于，
8.根据权利要求7所述检测啶虫脒的方法，其特征在于，步骤如下：
9.根据权利要求8所述检测啶虫脒的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的亚甲基蓝溶液由以下方法制得：
10.根据权利要求8或9所述检测啶虫脒的方法，其特征在于，所述步骤(6)中DPV峰电流值-啶虫脒浓度对数的标准曲线由以下方法制得：
...【技术特征摘要】
1.一种基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，包含如下组分：
2.根据权利要求1所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述啶虫脒的核酸适配体aptamer的核酸序列如seq id no:1所示。
3.根据权利要求2所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述dna1的核酸序列如seq id no:2所示；所述dna环探针的核酸序列如seq id no:3所示；所述dna2的核酸序列如seq id no:4所示。
4.根据权利要求1所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述lig传感电极由以下方法制备而成：
5.根据权利要求1-4任一项所述基于生物传感器的啶虫脒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，王玥，刘晓娟，王钰莹，薛杨，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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